从葡萄牙市场上销售的海鲜样本中分离出的霍乱弧菌（Vibrio cholerae）菌株的初步特性分析

《The Microbe》：Preliminary characterization of Vibrio cholerae strains isolated from seafood samples marketed in Portugal

　　霍乱弧菌在葡萄牙海鲜中的分布及基因特征研究显示，33.3%的样本（虾41份，牡蛎2份）检出非O1/O139霍乱弧菌（NOVC），携带多种毒力基因如纳米凝集素（nanH）和霍利克斯毒素（chxA），但缺乏主要毒力因子ctxAB。全基因组测序（WGS）发现8株呈现多重耐药性（MDR），并鉴定出6个遗传簇（ST829、ST833、ST1085）。核心基因组多序列分型（cgMLST）分析表明，这些菌株与全球其他来源的NOVC存在一定遗传关联，凸显One Health策略的重要性。

　　
本研究针对葡萄牙市场销售的海鲜产品中非O1/O139型霍乱弧菌（NOVC）的分布特征、毒力因子及耐药性展开调查，并通过全基因组测序（WGS）和核心基因组多 locus 序列分型（cgMLST）技术揭示其遗传关联性。研究共检测129份样本（105份冷冻虾、24份生牡蛎），结果显示33.3%的样本（43份）携带NOVC菌株，其中虾类污染率高达39.1%，显著高于牡蛎的8.3%。值得注意的是，所有分离菌株均未携带导致典型霍乱症状的ctxAB毒素基因，但检测到多种替代性毒力因子。

在毒力基因分析方面，研究发现所有菌株均具备MARTX毒素（rtxA基因）、溶血素（hlyA基因）和cholix毒素（chxA基因）编码基因，其中18份（41.9%）携带神经氨酸酶基因（nanH），形成完整的VPI-2致病岛。部分菌株（如编号5和35）还携带β-内酰胺酶基因（varG）和新型碳青霉烯酶基因（CARB-2），提示可能存在抗生素耐药性传播风险。特别值得注意的是，编号31的菌株完整保留了VPI-2致病岛，而编号5的菌株检测到部分VSP-II基因，这些发现均表明NOVC菌株具有潜在的毒力进化能力。

耐药性检测显示76.9%的菌株对至少一种测试抗生素存在耐药性，其中8份（20.5%）被归类为多重耐药菌（MDR）。研究发现varG基因与氨苄青霉素耐药性呈显著关联（5/8 MDR菌株携带varG），但parE基因（氟喹诺酮类耐药相关基因）与环丙沙星耐药性未呈现明确相关性。特别值得关注的是，编号9的菌株虽携带catB9氯霉素耐药基因，但实验显示其对氯霉素敏感，这提示需结合基因型和表型数据综合评估耐药性。

遗传分型方面，通过cgMLST分析将43株NOVC分为6个遗传集群（ST829、ST833、ST1085），其中ST833集群占比较大（5株）。进一步比较分析显示，葡萄牙分离株与厄瓜多尔、印度、委内瑞拉等地的环境或临床菌株存在遗传关联，例如与厄瓜多尔分离株的相似度达85%-95%。值得注意的是，编号36和37的葡萄牙本地牡蛎样本分离株，在核心基因组分型中与南美环境菌株形成独立集群，提示可能存在本地适应性进化。

研究创新性地结合毒力因子基因（177个）和抗生素耐药基因（CRP、varG、qnr等）的整合分析，发现以下关键特征：1）所有菌株均携带完整的 flagella 运动系统相关基因（包括mshA基因）；2）93%的菌株携带hasR基因，暗示可能通过铁载体系统增强环境适应性；3）超过半数菌株同时携带毒力相关基因（如nanH）和耐药基因（如varG），这种基因组合可能增强其在宿主或环境中的竞争力。

在生态传播路径方面，研究证实水生生物（如浮游甲壳类和蚊类幼虫）可作为中间宿主传播机制。测序数据显示，部分菌株同时携带VPI-2和VSP-II基因片段，这种基因组的可塑性可能通过水平基因转移实现。例如，编号5的菌株在缺失完整VSP-II的同时携带部分基因，而编号31的菌株完整保留VPI-2，提示环境菌株可能通过基因获得增强毒力。

对于食品安全管理，研究揭示了冷冻处理可能降低霍乱弧菌检出率（实际污染率可能高于39.1%），而牡蛎的生食特性使其成为高风险载体。建议建立基于分子分型的动态监测体系，重点关注ST833、ST829等高频型别。此外，发现环境菌株普遍携带marR基因突变（3/43菌株），这可能与多重耐药表型的形成相关，提示需加强抗生素压力下基因突变的监测。

研究对One Health策略的实践具有重要指导意义。通过比较207株全球分离株的遗传关系，发现印度和乌克兰的环境菌株存在高相似度（≤20 ADs），这可能与跨境贸易和气候变化导致的病原体扩散有关。同时，葡萄牙本地分离株与南美环境菌株的基因距离（>20 ADs）表明可能存在地理特异性进化路径。建议欧盟建立跨国界的水产品溯源系统，并加强冷链运输中的生物监测。

在公共卫生应对方面，研究证实NOVC菌株可通过多种途径传播，包括水产品进口、水鸟迁徙和海洋环流等。检测到的CRP基因（100%携带率）可能通过调节群体感应系统增强生物膜形成能力，这解释了为何在虾壳表面（含大量甲壳素）检测到高频率的菌株定植。建议在风险评估中纳入生物膜形成能力等新型毒力指标。

最后，研究揭示了抗生素耐药基因（如qnrVC4/5/7）在NOVC中的普遍存在性（27/43菌株携带varG或CARB-2），但表型耐药性检测显示存在基因-表型脱钩现象（如编号9菌株）。这提示传统的基于基因组的耐药性预测模型可能需要优化，应结合环境压力条件（如温度、盐度）进行综合评估。研究结果为制定针对性消毒方案（如加强甲壳类食品的壳体处理）和动态耐药监测网络提供了科学依据。