胰蛋白酶（EC 3.4.21.4）是一种由胰腺分泌的重要丝氨酸蛋白酶，可催化蛋白质水解为较小的肽段，提高其生物利用度。胰蛋白酶在食品工业中用于蛋白质鉴定，并在临床实践中用于促进伤口愈合和作为抗炎清洁剂，因为它有助于分离粘附细胞。然而，胰蛋白酶水平异常会导致严重的疾病，如胰腺炎、胰腺癌、囊性纤维化和胆汁性肝硬化[1]。已知某些类型的胰腺疾病会导致胰蛋白酶水平升高。据报道，急性胰腺炎患者的平均血清胰蛋白酶浓度为1400 ng/mL，而健康个体的浓度范围为140至400 ng/mL[2]。此外，胰蛋白酶抑制剂作为治疗胰腺炎、休克和由纤维化引起的弥漫性血管凝固的新药物显示出巨大潜力。因此，开发一种简单易用的胰蛋白酶活性检测方法和抑制剂筛选方法具有重要意义。
目前，胰蛋白酶的检测主要依赖于两种不同的方法：基于亲和力的方法和基于活性的检测方法[3]。基于亲和力的检测通常使用结合伴侣，包括抗体或蛋白酶模板。例如酶联免疫吸附测定[4]、放射免疫测定[5]和分子印迹技术[6]等。基于活性的检测通常使用具有明确序列的合成短肽底物。基于活性的胰蛋白酶检测方法包括电化学测定[7,8]、比色测定[9,10]和荧光测定[11,12]、凝胶电泳[13]以及化学发光[14]。鉴于现有方法的局限性，如成本高、速度慢以及依赖标记或复杂仪器，迫切需要开发一种简单、经济高效且无标记的快速胰蛋白酶检测方法。
近年来，基于纸张的传感器由于其独特的优势（如资源消耗低、经济高效、良好的生物相容性、便携性和易获取性）成为生物传感领域的有吸引力的平台[[15], [16], [17], [18], [19]]。这使得它们非常适合在缺乏专业设备的偏远地区进行即时检测（POCT）。一个重要的发展是基于纸张的距离读出传感器[[20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32]]，通过测量纸张基底上可见信号的迁移长度来量化目标分析物的浓度。这种方法消除了对复杂读出设备或仪器的需求。例如，Xu等人[23]开发了一种新型基于纸张的传感器，通过简单的尺子测量来定量检测有机磷农药，该方法基于乙酰胆碱酯酶介导的海藻酸盐凝胶化来调节溶液粘度。Zhang等人[24]开发了一种结合视觉距离读出技术的基于纸张的传感器，用于基于尿素酶介导的壳聚糖粘度变化进行尿素的即时检测。Yu等人设计了一种多功能基于纸张的距离传感器，能够高灵敏度地检测碱性磷酸酶（ALP）和甲胎蛋白，因为ALP催化的溶胶-凝胶转变会引起粘度变化。
在本研究中，开发了一种简单、便捷且经济高效的基于纸张的传感器来检测胰蛋白酶，并进一步将其应用于筛选10种传统中药中的胰蛋白酶抑制剂。如图1所示，含有或不含胰蛋白酶的明胶水凝胶分别沉积在混合纤维素酯（MCE）滤纸上。由于明胶的高粘度，其扩散直径较小。当被胰蛋白酶水解后，明胶的粘度降低，扩散直径扩大。通过测量纸上斑点的扩散直径差异，可以定量测定胰蛋白酶的浓度。该传感器在抑制剂筛选测试中也表现出优异的性能。简单的制备过程和直观的操作原理使其非常适合即时检测（POCT）。这项工作的关键创新在于开发了一种无需设备的基于距离的纸张传感器，仅使用游标卡尺即可定量检测胰蛋白酶及其抑制剂。该方法利用胰蛋白酶引起的明胶粘度变化，实现了无标记检测，无需固定化生物分子、纳米材料或复杂仪器。这些特点凸显了其在实际POCT应用和未来商业化方面的巨大潜力。
