由DNA拓扑异构酶IIα和活性氧物种引起的DNA双链断裂会导致外源DNA整合到宿主基因组中

《Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis》：DNA double-strand breaks induced by DNA topoisomerase IIα and reactive oxygen species lead to the integration of foreign DNA into the host genome

　　随机整合由Top2α介导的DSBs和ROS引发，抑制Top2α或培养于低氧环境可降低整合频率，二者协同作用效果更显著，影响基因靶向效率。

　　

黑泽彩（Aya Kurosawa）| 上原雅纯（Masumi Umehara）| 良高足立（Noritaka Adachi）

横滨市立大学纳米生物科学研究生院，日本横滨236-0027

摘要

外源DNA在引入细胞后，会以较低的频率和随机位置整合到基因组中。这种现象称为随机整合，发生在DNA双链断裂（DSB）通过非同源末端连接或聚合酶θ介导的末端连接得到修复时，从而将外源DNA整合到基因组中。然而，随机整合过程中DSB产生的机制仍不清楚。在本研究中，我们探讨了DNA拓扑异构酶II（Top2）和活性氧（ROS）在生成DSB中的作用，并研究了它们对随机整合频率的影响。在Nalm-6细胞中，使用Top2抑制剂依托泊苷和过氧化氢处理后，随机整合频率增加。相反，Top2α的耗竭和低氧条件培养独立地降低了随机整合频率，两者结合使用时，随机整合频率进一步降低。在HPRT位点的基因靶向实验中，Top2α的耗竭和低氧培养同样降低了随机整合频率。这表明由Top2α和ROS产生的DSB促进了随机整合，并阻碍了高效的基因靶向。

引言

随机整合是指外源DNA在引入细胞后，在染色体DNA的随机位点被整合的过程[1]。这种现象可能发生在通过DSB修复途径（如非同源末端连接（NHEJ）和聚合酶θ介导的末端连接（TMEJ）修复DNA双链断裂（DSB）的过程中[2]。随机整合常用于生成稳定的过表达细胞系；然而，在通过同源重组进行基因靶向时，由NHEJ或TMEJ介导的非同源重组导致的随机整合会影响靶向效率。因此，了解随机整合的机制及其有效控制方法对于转基因生物的开发至关重要。然而，DSB产生的机制仍不清楚。尽管DSB诱导剂可以增强随机整合，但即使没有这些处理，随机整合也可能发生，这表明细胞培养过程中内源性和外源性因素都可能促进随机整合。

Top2通过产生短暂的DSB，然后进行重新连接，从而催化DNA和染色体的拓扑结构变化[3]。哺乳动物细胞中含有两种Top2异构体：Top2α和Top2β，它们具有约70%的氨基酸同源性。活性氧（ROS），包括超氧阴离子自由基、过氧化氢和羟基自由基，是高反应性的氧衍生物，能够引起DNA损伤，包括DSB[4],[5]。ROS主要通过线粒体电子传递系统在细胞中产生，存在形式为超氧阴离子自由基和过氧化氢。据估计，线粒体产生的ROS占呼吸作用消耗氧气的0.15–2%[6]。然而，培养细胞所暴露的氧化应激水平比体内条件更高[7],[8]。我们之前的研究表明，在pre-B细胞系Nalm-6中，由Top2α产生的DSB对随机整合影响较小，而由Top2β产生的DSB则促进随机整合[9],[10]。我们还观察到，在转染外源DNA后，细胞在3% O₂条件下培养时，随机整合频率降低[9]。然而，进一步的研究可以明确抑制Top2α表达和低氧培养是否对随机整合频率有叠加效应。此外，Top2α和ROS引起的DSB对外源DNA（如靶向载体）中包含的基因组同源序列的随机整合的影响尚未完全探索。

在本研究中，我们分析了Top2α和ROS水平对随机整合的影响。

实验部分

细胞培养

人类pre-B急性淋巴细胞系Nalm-6及其衍生物TOP2B–/–细胞在Eagle's MEM培养基（Nissui Seiyaku，东京，日本）中培养，培养基中添加了10%的小牛血清（Cytiva，东京，日本）、2 mM MEM非必需氨基酸（Wako Pure Chemical，大阪，日本）、1 mM丙酮酸钠（Wako Pure Chemical）、50 μM 2-巯基乙醇（Wako Pure Chemical）和0.1 mg/L维生素B₁₂（Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国），培养条件为5% CO₂，温度37°C [11]。TOP2B–/–细胞是通过特定方法生成的

随机整合频率受Top2活性和ROS的影响

首先，我们检查了在Top2抑制或ROS过度诱导DSB的情况下随机整合的频率（图1A）。整合频率是根据将含有嘌呤霉素抗性基因但缺乏基因组同源序列的质粒pLucPuro引入Nalm-6野生型细胞后产生的嘌呤霉素抗性克隆的数量来计算的。与先前的报告一致，pLucPuro在野生型细胞中的整合频率增加了10–25倍

CRediT作者贡献声明

黑泽彩（Aya Kurosawa）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、项目管理、方法学设计、实验设计、数据分析、概念构思。上原雅纯（Masumi Umehara）：实验设计、数据分析。良高足立（Noritaka Adachi）：撰写 – 审稿与编辑、项目管理、资金筹集、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢Kamekawa Haruna和Uehara Kokona在本研究中的技术协助。同时，我们也感谢iPS细胞研究与应用中心（CiRA）的Nakamura Sou博士在iPS细胞处理方面的宝贵建议。此外，我们还要感谢东京大学医学科学研究所的干细胞银行提供的TkDN 4-M人类iPS细胞系。本工作得到了日本学术振兴会（JSPS KAKENHI）科学研究费（B类资助）（项目编号JP15H04323）的支持。

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