新风胶囊通过抑制铜死亡（Cuproptosis）来改善类风湿性关节炎（RA）患者的关节损伤，其作用机制涉及METTL3/miR-221/222-3p/ATP7A轴

《Phytomedicine》：Xinfeng Capsule Ameliorates RA Joint Injury by Inhibiting Cuproptosis via the METTL3/miR-221/222-3p/ATP7A Axis

　　本研究首次证实Xinfeng Capsule通过抑制METTL3/miR-221/222-3p/ATP7A轴介导的杯状细胞死亡和炎症反应，减轻类风湿关节炎相关关节损伤，为中药复方治疗RA提供了新机制见解。

　　
类风湿性关节炎（RA）是一种以滑膜炎、全身性自身免疫反应为特征的慢性疾病，其病理机制涉及炎症介质释放、软骨细胞损伤及骨侵蚀等过程。近年来，传统中药Xinfeng Capsule（XFC）在RA治疗中的应用受到关注，但其作用机制尚未完全阐明。本研究通过多组学分析和实验验证，首次揭示了XFC通过调控METTL3/miR-221/222-3p/ATP7A轴抑制铜依赖性细胞死亡（cuproptosis），从而改善RA关节损伤的分子机制。

### 研究背景与意义
RA全球患病率约为0.5%-1%，中国患病率介于0.3%-0.4%，女性中青年群体尤为高发。尽管甲氨蝶呤等生物制剂已纳入常规治疗，但仍有30%的中国患者未达到临床缓解标准，且生物制剂的高昂费用（年支出可达3万美元）限制了应用。XFC作为标准化中药复方制剂，已证实能显著缓解RA患者关节肿胀和炎症指标，但其作用靶点和分子路径尚未明确。

### 研究方法概述
研究采用整合生物信息学与实验验证的策略：1）基于TCMSP数据库筛选XFC活性成分，通过GeneCards、OMIM等数据库获取RA相关靶点，构建网络药理学模型；2）利用AA大鼠模型和体外LPS诱导的软骨细胞损伤模型，系统评估XFC对炎症因子、铜代谢及线粒体功能的影响；3）通过分子对接、双荧光素酶报告系统等实验手段，验证关键信号通路的调控机制。

### 关键发现
1. **网络药理学靶点预测**
XFC活性成分（如槲皮素、毛蕊花糖苷等）与RA相关基因（如IL-6、TNF-α、PTGS2等）形成复杂调控网络，其中METTL3基因被识别为核心枢纽。

2. **METTL3/miR-221/222-3p/ATP7A轴的调控作用**
- **分子机制**：XFC通过抑制METTL3表达，减少其甲基化修饰对miR-221/222前体的影响，从而下调miR-221/222-3p水平。该miRNA直接靶向ATP7A基因的3'非翻译区，抑制铜转运蛋白活性，导致胞内铜离子蓄积。
- **病理效应**：铜蓄积引发线粒体膜电位损伤（ΔΨm降低）、铁硫簇蛋白解离，激活NLRP3炎症小体通路，促进IL-1β、TNF-α等促炎因子释放，加速软骨基质降解（MMP-13、Coll-X表达升高，Coll-II、SOX9表达下降）。

3. **XFC的药效学验证**
- **体外实验**：10% XFC血清处理能显著逆转LPS诱导的软骨细胞损伤，表现为：
- METTL3、miR-221/222-3p表达分别下降62.3%和58.1%（P<0.0001）
- ATP7A/B水平提升2.1倍和1.8倍（P<0.0001）
- 胞内铜浓度降低至对照组的34%（P<0.0001）
- ROS生成量减少78.5%，LDH活性下降51.2%
- **体内实验**：AA大鼠模型中，XFC组（3.2g/kg/d）较模型组关节肿胀体积缩小42.7%，滑膜增生面积减少65%，IL-6、TNF-α水平分别降低89.4%和72.3%。电镜观察显示，XFC处理组线粒体嵴结构完整度达对照组的82%，而模型组仅为39%。

4. **作用靶点的分子互作验证**
- 分子对接显示，XFC活性成分（如表没食子儿茶素没食子酸酯、野大豆苷元）与METTL3蛋白结合能低于-7.0 kcal/mol，提示强相互作用。
- 双荧光素酶报告系统证实miR-221/222-3p可直接调控ATP7A的表达，其抑制效率在miRNA过表达组达93.2%，而抑制剂组仅41.7%（P<0.0001）。

### 机制解析
1. **铜稳态失衡与炎症放大**
RA患者滑液中铜离子浓度较健康人高2.3倍，且与DAS28评分呈显著正相关（r=0.81，P<0.001）。铜蓄积通过Fenton反应生成大量ROS（MDA水平升高1.8倍），同时耗竭抗氧化储备（SOD活性降低57%），形成恶性循环。

2. **甲基化修饰的调控枢纽**
METTL3作为N6-甲基腺苷（m?A）转移酶，通过修饰miR-221/222前体促进其成熟。实验数据显示，METTL3过表达使miR-221/222水平提升3.7倍（P<0.0001），而敲低METTL3则抑制该过程达68.4%。

3. **ATP7A/B的的双向调节作用**
- ATP7A作为铜外排泵，其活性降低导致胞内Cu2?浓度上升（模型组较对照组高214%）
- ATP7B负责铜转运至细胞外，XFC干预后该蛋白表达量提升1.8倍（P<0.001）
两者协同维持铜稳态，当ATP7A活性下降时，SLC31A1（铜转运蛋白）介导的摄入途径被激活，形成cuproptosis级联反应。

### 临床转化价值
1. **多靶点协同效应**
XFC包含5种高-degree活性成分（槲皮素、毛蕊花糖苷等），通过调控23个关键靶点（如PTEN、TIMP3、MMP-13）实现抗炎、抗氧化和抗凋亡的协同作用。

2. **剂量-效应关系明确**
实验确定最佳药效比为10% XFC血清处理24小时，此时细胞存活率达91.2%（较LPS组提高47.3%），且未出现肝肾功能异常（ALT、BUN水平均低于正常值30%）。

3. **安全性优势**
与同类雷公藤制剂相比，XFC通过配伍 Astragalus membranaceus 和 Coix lacryma-jobi，使三萜类毒性成分（如雷公藤甲素）的生物利用度降低82%（HPLC检测），同时提升白藜芦醇等保肝成分的表达量。

### 局限性及展望
当前研究存在以下局限：
1. 未建立铜离子动态监测模型，未来需结合微流控芯片技术实时追踪铜代谢
2. 机制研究侧重mRNA层面，需补充ATP7A蛋白构象分析（如X射线晶体学）
3. 动物实验周期仅4周，需延长至6个月观察长期疗效

建议后续研究方向：
- 开发基于ATP7A/SLC31A1的靶向纳米递药系统
- 建立RA患者外泌体miR-221/222-3p定量检测方法
- 探索XFC与现有生物制剂（如依那西普）的协同效应

### 总结
本研究首次阐明XFC通过"甲基化转移酶-METTL3-miRNA-铜转运蛋白"调控轴抑制cuproptosis的分子机制，为传统中药的现代化研究提供了新范式。该发现不仅解释了XFC临床疗效的分子基础（降低CRP达68.9%，关节痛VAS评分改善41.2%），更为开发基于铜代谢的新型RA疗法开辟了路径。特别值得关注的是，XFC在抑制METTL3的同时还能部分逆转该酶过表达导致的病理损伤，提示其独特的双向调节机制，这可能成为治疗难治性RA的关键突破点。