开发一种基于生物炭的微生物制剂，以增强枯草芽孢杆菌对棉花黄萎病的生物防治效果

《Sustainable Materials and Technologies》：Construction a biochar-based microbial agent for boosting biocontrol of Bacillus subtilis on cotton verticillium wilt

　　本研究利用KOH/尿素共改性核桃皮生物炭（KNWP）固定解淀粉芽孢杆菌BS191，构建生物炭基微生物制剂K-BS191，有效防治棉花立枯病（抑菌率93.83%，田间控制效率88.76%），并提升土壤肥力及作物生长，为可持续生物防治提供新策略。

　　

王云云|王露露|秦宇|杜晓盼|梁慕涵|高波|张根林

摘要

生物控制剂（BCAs），如枯草芽孢杆菌，为管理植物病害提供了环保的替代方案。然而，由于复杂的土壤环境因素，BCAs的应用常常受到限制，导致存活率和病害控制效率低下。基于活性功能基团在生物炭表面的吸附作用，我们将枯草芽孢杆菌 BS191固定在生物炭（KNWP）上，制备了一种基于生物炭的微生物制剂（K-BS191），用于防治由大丽轮枝菌引起的棉花立枯病。结果表明，K-BS191对大丽轮枝菌 V592表现出强烈的抑制作用，其抑菌率比枯草芽孢杆菌 BS191悬浮液高28.30%。K-BS191的有效活菌数为1.52×10¹⁰ CFU/g，在室温下储存180天后仍保持在7.75×10⁹ CFU/g。盆栽试验证实，K-BS191不仅通过防治立枯病（控制效率为88.76%，比枯草芽孢杆菌 BS191高19.67%）促进了棉花生长，还通过提高土壤肥力和重建有益微生物群落发挥了作用。本研究的结果为开发可持续的棉花立枯病生物控制策略做出了贡献。

引言

棉花立枯病是一种由大丽轮枝菌引起的土传维管束病害，表现为叶片黄化、生长受阻，最终导致植株死亡，对棉花产量和纤维质量构成严重威胁[1]。目前，化学杀菌剂是主要的病害控制手段[2,3]。然而，长期使用化学药剂不仅会导致病原体产生抗性（降低控制效果），还会带来潜在的环境风险[4]。因此，基于拮抗微生物的生物控制技术作为一种有前景的替代或补充策略应运而生，利用其固有的环境兼容性和可持续性[[5], [6], [7]]。然而，生物控制剂的实际应用面临诸多挑战：复杂的土壤环境常常导致存活率低和定殖效率差，从而影响病害控制效果的稳定性[8]。

为克服这一限制，研究人员开发了微生物固定技术[9]。生物炭作为一种微生物固定载体，在生物控制领域显示出显著优势，近年来已成为传统材料（如海藻酸钠和硅基材料）的理想替代品。与机械强度不足的有机材料或具有生态风险的无机材料相比，生物炭通过其分级孔结构（孔径1–100 nm）为微生物（大小0.5–5 μm）提供了物理庇护所。同时，其表面丰富的羧基/羟基功能基团通过氢键作用增强了微生物的定殖稳定性[10,11]。然而，原始生物炭仍存在一些局限性，如表面化学惰性、功能基团多样性有限以及电荷分布不均匀，这些因素限制了其微生物吸附能力和固定稳定性[[12], [13], [14], [15]]。

KOH活化可以通过蚀刻作用扩大生物炭的孔结构并增加比表面积。尿素热解过程中释放的含氮基团（如氨基、吡啶氮）能够针对性地改变生物炭的表面电荷和功能基团多样性。这种双重功能的“物理化学改性”策略不仅可以优化载体的微观形态，还能增强与微生物细胞壁成分（如肽聚糖、壁酸）的静电吸引力或氢键作用，从而显著提高生物炭的微生物吸附能力和固定效果[16]。例如，经过硼酸-CaCl交联改性的铁改性生物炭在水中对菲的去除率达到30%[13]；而生物炭介导的枯草芽孢杆菌 SL-44菌株（BC@SL）对引起水稻鞘枯病的立枯丝核菌具有防御作用，并能促进植物生长[14]。因此，选择合适的生物控制剂（BCAs）和进行配方设计对于实现高效的微生物负载和工程应用至关重要。枯草芽孢杆菌具有广谱拮抗性和出色的环境适应性[17,18]。传统的吸附方法往往存在孔结构不佳或载体材料表面亲和力不足的问题，导致微生物负载率低、细胞活力受损、根际定殖效率低以及功能持久性差。因此，优化关键参数（如载体与悬浮液的比例、固定温度和固定pH值）对于提升制剂性能至关重要[19,20]。

在本研究中，我们使用核桃果皮作为原料，通过KOH/尿素共改性制备了高性能生物炭（KNWP），并将其作为载体用于固定枯草芽孢杆菌 BS191，从而开发了一种用于可持续高效控制棉花立枯病的生物炭基微生物制剂（K-BS191）。随后通过工艺优化和盆栽实验验证了K-BS191的生物控制效果。K-BS191在体外对大丽轮枝菌 V592的抑菌率为93.83%，在盆栽试验中对棉花立枯病的控制效果为88.76%。这项研究为制定针对棉花立枯病的定制化生物控制策略提供了宝贵见解。

生物炭的制备与表征

废弃的核桃果皮经过清洗、烘干、粉碎和筛分后，在N?气氛下使用高温管式炉（OTF-1200×，中国）进行热解：以5°C/min的升温速率加热至800°C，然后保持2小时恒温。冷却后的产物经去离子水冲洗至中性pH值，并在60°C下干燥12小时，得到核桃果皮生物炭（WP）。WP粉末通过KOH活化（KOH，Macklin，中国）或氮掺杂进行化学改性

改性生物炭的表征

微生物在载体上的定殖和功能实现很大程度上取决于支撑基质的微观结构[27]。直接观察生物炭的微观结构可以为优化载体设计提供实证基础。扫描电子显微镜（SEM）显示，核桃果皮生物炭（WP）的表面结构相对平坦，存在一些微孔和突起。KOH活化和氮掺杂（尿素改性）均独立提高了WP的孔隙率。

结论

本研究开发了一种简单且环保的基于生物炭的微生物制剂（K-BS191），用于防治棉花立枯病。KOH/尿素共改性的生物炭（KNWP）主要通过单层物理吸附固定了枯草芽孢杆菌 BS191。K-BS191的有效活菌数为1.52×10¹⁰ CFU/g，在室温下储存180天后仍保持在7.75×10⁹ CFU/g，超过了规定的最低活菌数要求

作者贡献声明

王云云：撰写 – 原稿撰写、软件使用、方法设计、实验研究。王露露：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、软件使用、资源获取、方法设计、实验研究、数据整理、概念构建。秦宇：软件使用、方法设计。杜晓盼：软件使用、资源获取。梁慕涵：软件使用、方法设计。高波：撰写 – 审稿与编辑、资金筹集。张根林：撰写 – 审稿与编辑、方法设计、资金筹集、概念构建。

利益冲突声明

作者声明没有与本文内容相关的利益冲突。

致谢

本研究得到了新疆科技厅（2024YD009、2022AB008、2022CB010-01）和“天山英才”培训计划的支持。