利用噬菌体Carin-5自身DNA聚合酶破解其胸腺嘧啶超修饰基因组的测序难题

《Scientific Reports》：Exploitation of phage Carin-5’s own DNA polymerase to sequence its T-hypermodified genome

　　本研究针对噬菌体Carin-5基因组因存在胸腺嘧啶(T)超修饰而难以测序的难题，创新性地利用其自身编码的DNA聚合酶进行体外复制，成功获得非修饰DNA并完成全基因组测序。该策略为解析同类“暗物质”噬菌体基因组提供了通用方案，并揭示了其与SP-15等噬菌体共同构成的新型RP13-like家族特征。

　　

在微生物世界的军备竞赛中，噬菌体与宿主细菌共同演绎着永恒的进化之舞。其中，一些噬菌体发展出了一种精妙的防御策略：对其遗传物质DNA进行复杂的化学修饰。这种修饰如同给基因组穿上了一件“隐形斗篷”，能有效抵御宿主细菌限制性内切酶和CRISPR-Cas系统的攻击。然而，这件“斗篷”在保护自身的同时，也成为了科学家们认识它们的巨大障碍。因为目前主流的高通量测序技术严重依赖于DNA聚合酶对模板链的识别和复制，而庞大的化学修饰基团会严重阻碍普通DNA聚合酶的前进，导致测序失败。这使得一大批拥有高度修饰基因组的噬菌体成为了基因组学领域的“暗物质”，其生物学特性和进化意义长期被掩盖。

近期，一项发表于《Scientific Reports》的研究成功破解了这一难题。研究人员以一株名为Carin-5的海洋肌尾噬菌体为研究对象，它能够感染生产胞外多糖的海洋γ-变形菌纲细菌Cobetia marina。初步的测序尝试表明，Carin-5的基因组如同一个坚固的堡垒，标准的Illumina测序流程难以攻破，仅能获得一些零散的基因组片段。这一困境与感染耶尔森菌的噬菌体YerA41和感染青枯菌的噬菌体RP13所面临的情况如出一辙，暗示着Carin-5的DNA同样存在着不寻常的修饰。

为了攻克这一堡垒，研究团队采取了一种“以子之矛，攻子之盾”的巧妙策略。既然外源的DNA聚合酶无法读取这套高度修饰的“密码”，那么制造这套“密码”的噬菌体自身，必然拥有能够解读它的专用“钥匙”——其自身编码的DNA聚合酶。果然，在初步获得的基因组片段中，研究人员成功找到了编码DNA聚合酶的基因。他们将该基因在大肠杆菌中进行异源表达并纯化出了相应的蛋白质。体外实验证明，这种Carin-5自身的DNA聚合酶能够有效地以其高度修饰的基因组为模板，合成出未经修饰的“纯净”DNA拷贝。经过此酶处理后的DNA，立刻变得对常规PCR和Illumina测序“友好”，最终成功获得了覆盖度高达352倍的完整环状基因组序列，其大小为154,621碱基对。

本研究的关键技术方法主要包括：噬菌体培养与基因组的纯化、Illumina二代测序与基因组拼接、噬菌体DNA聚合酶基因的异源表达与蛋白质纯化、利用噬菌体自身DNA聚合酶进行体外基因组复制、液相色谱-质谱联用分析核酸修饰、以及生物信息学工具进行基因组注释与比较基因组学分析。用于测序的噬菌体Carin-5分离自大西洋沿岸海水。

First sequencing and partial assembly

最初，使用标准的Illumina测序流程对纯化的Carin-5基因组DNA进行测序时，遇到了巨大困难。即便在文库构建中加入了预扩增步骤，最终的组装结果也未能产生完整的噬菌体基因组 contig，反而大部分测序读长都比对到了宿主Cobetia marina或污染物Chitinophaga的基因组上。经过过滤去除宿主和污染源读长后，重新组装得到约十个覆盖度较高的 contig，但它们彼此不连续，预示着基因组中存在严重阻碍测序的位点。

DNA polymerase discovery

对获得的 contig 进行注释和BLASTp同源性搜索后，发现其中一个基因编码的蛋白质与已知难以测序的噬菌体YerA41的DNA聚合酶有43.2%的同一性。这提示该蛋白可能是破解测序难题的关键。研究人员随后克隆并纯化了Carin-5的DNA聚合酶。

PCR after treatment

为了直接验证基因组修饰的存在，研究人员尝试用不同商业化的DNA聚合酶扩增Carin-5基因组内的特定片段，但均告失败。然而，若先用Carin-5自身的DNA聚合酶在体外与dNTPs共同孵育处理基因组DNA过夜，再用相同的商业酶进行PCR，则能成功扩增长达3000 bp的片段。此外，引物延伸实验表明，Carin-5 DNA聚合酶具有很高的保真度，与Taq DNA聚合酶相当，优于Bst DNA聚合酶。

Treatment and second sequencing

基于上述结果，研究团队用Carin-5 DNA聚合酶体外复制处理整个基因组，然后进行标准的Illumina测序。这次，无需预扩增，测序即获得成功，并组装出一条完整的、长度为154,676 bp的线性 contig。通过比较两次独立测序组装的序列，发现它们之间存在一个27,246 bp的位移，并在序列一端存在一个55 bp的重复区域，这表明Carin-5的基因组是环状置换的，其实际长度为154,621 bp。

BLASTn

将Carin-5的基因组序列在数据库中进行BLASTn比对，发现其25.5%的序列与已知噬菌体高度相似，其中绝大部分相似性集中于Yersinia phage vB_Yru_GN1和YerA41。排除这两者后，仅有1.5%的序列与数据库其他条目相似，强烈提示Carin-5属于Caudoviricetes纲中一个新的噬菌体家族。

Prokka, BLASTp and BV-BRC

基因组注释显示，Carin-5基因组包含222个预测基因和4个tRNA基因。其中47个基因被初步预测了功能。通过BV-BRC工具与YerA41进行蛋白质组比较，发现89个基因存在同源物。功能基因分析揭示了一系列与DNA复制、修饰相关的基因，包括一个A家族DNA聚合酶以及可能参与核苷酸糖修饰和糖基化的基因簇。

LC/MS-MS

液相色谱-质谱联用分析直接证实了Carin-5基因组DNA中存在超修饰的胸腺嘧啶，其修饰程度高达约75%。MS/MS质谱分析推测该修饰包含一个88 Da的连接子、一个磷酸基团以及一个寡糖链（包含己糖和N-乙酰氨基己糖等）。这种修饰模式与早年报道的噬菌体SP-15的胸腺嘧啶超修饰非常相似。对YerA41基因组的重新分析也确认了类似的超修饰胸腺嘧啶的存在。基因组注释在DNA聚合酶基因附近发现了一个编码糖修饰和糖基转移酶的基因块，推测负责构建这种复杂的胸腺嘧啶修饰。

综上所述，这项研究成功地利用噬菌体自身编码的DNA聚合酶，突破了因其基因组胸腺嘧啶超修饰而导致的测序瓶颈，完整解析了Carin-5的基因组序列。这不仅揭示了一个新的噬菌体家族的存在，更重要的是，它提供了一种普适性的策略来应对具有类似抗测序修饰的基因组，为挖掘和认识庞大的微生物“暗物质”资源打开了新的窗口。研究表明，Carin-5、YerA41、RP13以及SP-15等噬菌体共同构成了一类新的噬菌体家族，研究团队建议称之为RP13-like家族。这些噬菌体虽然感染不同的细菌宿主，但共享利用复杂的DNA修饰作为防御机制的策略，并且都编码一类特殊的、可能适应了其修饰模板的DNA聚合酶。这项工作深化了我们对噬菌体-宿主相互作用复杂性的理解，也为开发新的对抗抗生素耐药性策略提供了潜在的分子工具和思路。