SMP30通过调控Keap1/Nrf2/NQO1通路保护高糖诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤的机制研究

《Scientific Reports》：SMP30 May protect human lens epithelial cells against high glucose-induced oxidative damage by regulating the Keap1/Nrf2/NQO1 pathway

　　本研究聚焦糖尿病性白内障（DC）的防治难题，围绕衰老标记蛋白30（SMP30）在其中的作用机制展开探索。研究人员通过收集不同血糖控制水平DC患者的房水和晶状体前囊膜样本，并结合高糖刺激的人晶状体上皮细胞（HLE-B3）模型，发现SMP30可能通过调控Keap1/Nrf2/NQO1这一经典抗氧化通路，减轻高糖诱导的氧化应激损伤，提升细胞活力。该研究为DC的发病机制提供了新见解，并提示SMP30是潜在的治疗靶点。

　　

在全球糖尿病患病率持续攀升的背景下，糖尿病性白内障（Diabetic Cataract, DC）作为糖尿病患者视力受损甚至致盲的主要原因之一，其防治形势日益严峻。与健康人群相比，糖尿病患者罹患白内障的风险高出3-5倍，且发病年龄显著提前。尽管其发病机制复杂，涉及渗透压应激、多元醇通路、自身免疫等多种理论，但越来越多的证据表明，氧化应激可能是其中的关键环节。高血糖状态会导致晶状体蛋白的非酶糖基化，形成晚期糖基化终末产物（AGEs），并在此过程中产生活性氧（ROS），如超氧阴离子（O₂^•-）和过氧化氢（H₂O₂），进而引发DNA损伤、蛋白质氧化和脂质过氧化，最终导致晶状体混浊。Keap1/Nrf2/ARE通路是经典的抗氧化通路，在抵抗氧化应激损伤中扮演核心角色。然而，衰老标记蛋白30（Senescence Marker Protein 30, SMP30），又称Regucalcin，作为一种具有抵抗氧化损伤、维持细胞钙稳态、参与维生素C合成等多种功能的新型蛋白，其在DC发生发展中的作用及其与Keap1/Nrf2通路的关系尚不明确。

为了解决上述问题，来自桂林医科大学第一附属医院和广西医科大学第一附属医院的研究团队在《Scientific Reports》上发表了题为“SMP30 May protect human lens epithelial cells against high glucose-induced oxidative damage by regulating the Keap1/Nrf2/NQO1 pathway”的研究论文。该研究旨在探讨SMP30在不同血糖控制水平的DC患者以及高糖刺激的人晶状体上皮细胞中的作用和机制。

为开展此项研究，作者团队主要运用了以下关键技术方法：首先，他们收集了年龄相关性白内障（ARC）患者以及不同糖化血红蛋白（HbA1c）水平的2型糖尿病性白内障（DC）患者的房水和晶状体前囊膜样本，构成临床队列。其次，在细胞层面，他们使用人晶状体上皮细胞系（HLE-B3），通过给予不同浓度葡萄糖刺激来模拟高糖环境。关键实验技术包括：使用便携式血糖仪和高效液相色谱法（HPLC）分别检测葡萄糖和HbA1c浓度；采用超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）检测试剂盒评估氧化应激水平；通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法分析细胞活力；利用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和蛋白质印迹（Western Blot）技术检测SMP30及Keap1/Nrf2/NQO1通路相关因子的mRNA和蛋白表达；并通过流式细胞术使用DCFH-DA和DHE荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）水平。此外，研究还通过转染SMP30过表达质粒进行功能增益实验，以验证SMP30的保护作用及机制。

患者一般临床特征与血糖水平

研究共纳入180例年龄≥60岁的白内障患者，根据糖尿病状况和HbA1c水平分为三组：年龄相关性白内障组（ARC组）、DC伴HbA1c≤7%组（DCa组）和DC伴HbA1c>7%组（DCb组）。除DCb组患者年龄显著低于ARC组和DCa组外，其他基线特征无显著差异。如图1所示，DCb组患者的HbA1c水平、随机血糖以及房水葡萄糖浓度均显著高于ARC组和DCa组，这表明血糖控制不佳的患者体内（包括眼内）处于更高的糖负荷状态。

房水和血清中的氧化应激水平

氧化应激指标检测结果显示，与ARC组和DCa组相比，DCb组患者房水和血清中的MDA含量显著升高，而SOD活性显著降低（图2）。MDA是脂质过氧化的产物，其升高表明氧化损伤加剧；SOD是重要的抗氧化酶，其活性下降意味着抗氧化防御能力减弱。这些结果明确提示，在血糖控制不佳的DC患者中，全身及眼内局部都存在更严重的氧化应激状态。

晶状体前囊膜中SMP30及Keap1/Nrf2/NQO1通路因子的表达

令人感兴趣的是，尽管DCb组患者氧化应激水平更高，但其晶状体前囊膜中SMP30、Nrf2及其下游靶基因NQO1的mRNA（图3）和蛋白（图4）表达均显著上调，而Keap1的表达则下调。这表明，在血糖控制不佳但尚未出现严重并发症的DC患者晶状体上皮细胞（LECs）中，可能存在一种代偿性反应，即SMP30表达上调，并可能伴随Keap1/Nrf2/NQO1抗氧化通路的激活，以对抗加剧的氧化应激。

高糖对HLE-B3细胞活力及氧化应激的影响

体外细胞实验进一步验证了高糖的毒性作用。CCK-8检测显示，高浓度葡萄糖（≥40 mM）处理HLE-B3细胞会时间依赖性和浓度依赖性地抑制细胞活力（图5A）。同时，当葡萄糖浓度≥40 mM时，细胞内的MDA含量和ROS水平显著升高，SOD活性显著降低（图6A-C），表明发生了严重的氧化损伤。

高糖对HLE-B3细胞中SMP30及Keap1/Nrf2/NQO1通路的影响

机制探索发现，20 mM葡萄糖刺激可上调HLE-B3细胞中SMP30的表达，并激活Keap1/Nrf2/NQO1通路（表现为Keap1下调，Nrf2和NQO1上调）（图7A-D，图8A,B）。然而，当葡萄糖浓度升高至40 mM或60 mM时，SMP30的表达反而被抑制，Keap1/Nrf2/NQO1通路也受到抑制。这提示，适度应激（20 mM）可能激活细胞防御系统，而重度应激（≥40 mM）则可能导致防御系统崩溃。

SMP30过表达对高糖诱导的HLE-B3细胞的保护作用

为了明确SMP30的因果作用，研究人员构建了SMP30过表达的HLE-B3细胞模型。结果显示，过表达SMP30能显著逆转高糖（60 mM）引起的细胞活力下降（图5B），降低MDA含量和ROS水平，并提高SOD活性（图6D-F）。更重要的是，SMP30过表达还能逆转高糖对Keap1/Nrf2/NQO1通路相关因子表达的抑制作用，即上调Nrf2和NQO1，下调Keap1（图7E-H，图8C,D）。这强有力地证明，SMP30确实能够通过调控Keap1/Nrf2/NQO1通路来减轻高糖诱导的氧化应激损伤，从而保护晶状体上皮细胞。

综上所述，本研究通过临床样本分析和体外细胞实验相结合的方式，系统地阐明了SMP30在糖尿病性白内障中的保护作用及其分子机制。研究发现，在血糖控制不佳的DC患者以及经受急性重度高糖刺激的晶状体上皮细胞中，氧化应激损伤加剧。特别值得注意的是，在体内慢性、轻度高糖应激下，晶状体上皮细胞可能通过代偿性上调SMP30并激活Keap1/Nrf2/NQO1通路来抵抗氧化损伤；而当体外遭遇急性、重度高糖应激时，这种防御机制被抑制，导致细胞损伤。功能实验证实，过表达SMP30能够有效激活Keap1/Nrf2/NQO1通路，减轻氧化应激，提升细胞活力。这项研究首次揭示了SMP30在糖尿病性白内障中对晶状体上皮细胞的保护作用及其与Keap1/Nrf2通路的关联，不仅为理解DC的发病机制提供了新的视角，也为开发以SMP30为靶点的新型干预策略奠定了重要的理论基础，对糖尿病性白内障的预防和治疗具有潜在的重要意义。