连接蛋白32间隙连接通道构象的脂质依赖性及其在CMT1X疾病中的调控机制

《Nature Communications》：Lipid dependence of connexin-32 gap junction channel conformations

　　本研究针对脂质调控连接蛋白32（Cx32）间隙连接通道（GJC）通透性的分子机制不清问题，通过将Cx32重构至纳米盘并解析其冷冻电镜结构，发现胆固醇（CHS）与磷脂（POPC/LPL）协同稳定N端螺旋（NTH）构象，诱导形成通道“有序N端状态”（NO-state），导致孔径收缩至4 ?而阻断通透；CMT1X相关突变W3S因破坏胆固醇结合位点而无法形成NO-state。该研究首次揭示不同脂质物种直接调控连接蛋白通道门控的原子机制，为脂质介导的细胞间通讯调控及CMT1X病理机制提供了新见解。

　　

细胞间的“无线通信”如何精准调控？在人体内，数十万亿细胞需要通过高效的信息交流来协调生理功能。间隙连接通道（Gap Junction Channels, GJCs）作为细胞间直接通讯的“高速公路”，允许离子、代谢物和第二信使在相邻细胞间自由穿梭。其中，连接蛋白32（Connexin-32, Cx32）尤其重要，它不仅大量存在于肝细胞，更在形成髓鞘的施万细胞中发挥关键作用。然而，当Cx32基因发生突变时，就会导致X-连锁腓骨肌萎缩症（CMT1X），这是一种伴随周围神经脱髓鞘的遗传性疾病，目前尚无有效治疗方法。

尽管早前研究发现脂质（如脂肪酸、固醇和磷脂）能够调节Cx32通道的通透性，但其具体作用机制一直成谜。脂质究竟是通过改变细胞膜物理特性间接影响通道功能，还是直接与通道蛋白相互作用？不同类型的脂质如何协同调控通道的开闭？解答这些问题对理解细胞间通讯的精细调控及CMT1X的发病机制至关重要。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，研究团队通过将纯化的Cx32通道重构至两种脂质环境（POPC纳米盘和肝极性脂质LPL纳米盘）中，利用冷冻电镜技术解析了其高分辨率结构。令人惊讶的是，与在去垢剂中获得的Cx32结构相比，脂质环境中的Cx32的N端螺旋（N-terminal helix, NTH）从原本无序、贴靠孔道内侧的状态，转变为高度有序并指向孔道中心轴的构象。这种构象变化直接导致通道孔径从约15 ?收缩至12 ?。

进一步分析发现，这种被称为“有序N端状态”（NO-state）的构象由两种脂质分子共同稳定：一个是位于NTH下方的固醇类分子（被命名为lipid-2，鉴定为胆固醇hemisuccinate, CHS），另一个是结合于相邻NTH之间的磷脂分子（lipid-3，与POPC结构吻合）。当研究人员在纯化过程中不添加CHS时，Cx32的NTH无法维持有序构象，lipid-2和lipid-3的结合位点也随之消失。更引人注目的是，CMT1X相关突变W3S（色氨酸3突变为丝氨酸）也表现出类似现象：由于W3是保守的lipid-2结合残基，W3S突变体在脂质环境中同样无法形成稳定的NO-state构象。

分子动力学模拟结果与结构观察高度一致：野生型Cx32的NTH在结合胆固醇和POPC时稳定性显著增强，而W3S突变体的NTH则表现出明显的构象不稳定性，α-螺旋形成概率显著降低。主成分分析进一步揭示了Cx32单体的主要运动模式与脂质进入孔道的潜在路径相关。

关键技术方法包括：利用HEK293F细胞表达带有C端标签的人Cx32蛋白，通过抗GFP纳米抗体亲和层析和尺寸排阻色谱进行纯化；将纯化蛋白与膜支架蛋白MSP2N2及特定脂质（POPC或肝极性脂质LPL）组装成纳米盘；采用冷冻电镜单颗粒分析解析Cx32间隙连接通道在脂质环境中的高分辨率结构（最高分辨率达2.35 ?）；通过分子动力学模拟分析脂质与蛋白相互作用的动态过程。

脂质依赖性构象变化的结构基础

研究人员发现，在纳米盘脂质环境中，Cx32 GJC的整体结构与去垢剂中的结构相似，但NTH的构象发生显著变化。这种构象转变不依赖于跨膜区或胞外区的变化，而是由脂质特异性稳定。特别值得注意的是，两个关键的脂质结合位点被明确鉴定：lipid-2位点是一个疏水口袋，由W3侧链参与相互作用；lipid-3位点则由相邻亚基的M1、N2、G5和L9等残基形成。序列比对显示，这些关键残基在β-组连接蛋白中具有高度保守性，提示这种脂质调控机制可能广泛存在于连接蛋白家族。

胆固醇是磷脂依赖性孔道阻塞的先决条件

通过比较野生型Cx32在添加与不添加CHS条件下重构的纳米盘结构，研究证实CHS是形成NO-state的必要条件。缺乏CHS时，NTH采取一种沿孔道排列的构象，类似于开放状态。这表明固醇分子通过结合lipid-2位点为磷脂结合创造结构基础，两种脂质协同作用才能实现孔道的有效阻塞。

CMT1X相关突变W3S破坏脂质依赖性的构象调控

W3S突变体的结构分析显示，由于W3S突变破坏了固醇结合位点，突变体通道无法形成稳定的NO-state构象。这与分子动力学模拟结果一致：W3S突变显著降低了NTH的α-螺旋稳定性，增加了其构象波动。值得注意的是，W3S对GJC功能的影响远小于其对半通道（hemichannel）功能的影响，这提示脂质环境可能在不同通道形态中发挥差异化调控作用。

分子动力学模拟揭示脂质-蛋白相互作用的动态特性

扩展的分子动力学模拟不仅验证了实验观察到的构象变化，还提供了脂质-蛋白相互作用的动态视角。分析显示，胆固醇在野生型Cx32中保持相对稳定的结合构象，而在W3S突变体中则表现出更大的构象波动。同时，主成分分析识别出可能介导脂质从膜双层进入孔道内部的潜在路径，包括TM2-TM3界面形成的开口。

这项研究通过整合结构生物学和计算生物学方法，首次在原子水平揭示了不同脂质物种如何直接调控连接蛋白通道的门控机制。研究证明，胆固醇和磷脂通过协同作用稳定Cx32 GJC的特定构象状态，从而精细调控通道的通透性。这一发现不仅深化了对细胞间通讯分子机制的理解，也为CMT1X等连接蛋白相关疾病的治疗策略开发提供了新思路。特别值得注意的是，该研究建立的实验体系成功将膜蛋白重构至近生理脂质环境中，为今后研究其他膜蛋白的脂质调控机制提供了重要方法论参考。

研究还提出了许多有待探索的新问题：脂质如何从膜双层转运至孔道内部的结合位点？不同连接蛋白亚型是否共享类似的脂质调控机制？在生理条件下，哪些内源性脂质参与这一调控过程？这些问题的解答将进一步丰富我们对脂质-蛋白相互作用在细胞通讯中作用的认识。