H5N1流感血凝素宿主转换突变通过抑制位点特异性激活动力学影响病毒适应性

《Nature Communications》：Host switching mutations in H5N1 influenza hemagglutinin suppress site-specific activation dynamics

　　本研究针对高致病性H5N1禽流感病毒跨种传播机制，通过氢/氘交换质谱(HDX-MS)技术解析了血凝素(HA)蛋白的激活动力学特征。研究发现宿主适应性突变通过不同分子路径（Viet04株抑制融合肽释放，Indo05株稳定头部结构域界面）实现HA酸稳定性调控，揭示了流感病毒宿主适应的亚型特异性分子约束，为预测病毒进化趋势提供了新范式。

　　

当高致病性H5N1禽流感病毒在2021年末席卷北美时，野生鸟类和家禽种群遭遇了前所未有的死亡浪潮，更令人担忧的是病毒频繁溢出感染哺乳动物的事件——从貂、海豹到近期发现携带高病毒载量的奶牛乳汁。虽然目前尚未出现持续的人际传播，但病毒在哺乳动物间的传播能力提升无疑降低了人类感染风险。在这一背景下，理解流感病毒实现跨种传播的分子机制成为当务之急。

流感病毒表面的血凝素(Hemagglutinin, HA)糖蛋白是决定宿主嗜性的关键因子，它既负责识别宿主细胞表面的唾液酸受体，又在酸性环境下介导病毒与宿主膜的融合。既往研究表明，HA的酸稳定性和受体偏好性（从禽类偏好的α-2,3连接唾液酸转向人类上呼吸道富集的α-2,6连接唾液酸）是病毒获得空气传播能力的必要条件。然而，这些适应性突变如何影响HA蛋白的动态激活过程，特别是其从预融合状态到后融合状态的构象转变路径，始终是领域内未解之谜。

近日，《Nature Communications》发表了华盛顿大学Kelly K. Lee团队的研究成果。该研究首次采用氢/氘交换质谱(Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry, HDX-MS)技术，系统比较了三种H5N1病毒HA蛋白（越南株Viet04、印尼株Indo05的野生型及其传播适应性突变体，以及2022年分离自人感染病例的科罗拉多株Colo22）在酸性激活过程中的动态变化。研究发现，虽然不同毒株的适应性突变都能提升HA酸稳定性，但它们通过截然不同的分子机制实现这一目标：Viet04突变体通过T318I突变抑制融合肽动态，而Indo05突变体则通过H110Y突变稳定HA1/HA2界面。这种“殊途同归”的稳定化策略揭示了流感病毒宿主适应的物理约束机制。

关键技术方法方面，研究主要依赖HDX-MS解析蛋白动力学，通过蓝绿温和胶电泳(BN-PAGE)测定HA聚集阈值，负染色电镜验证三聚体形态，并利用定点突变技术构建传播适应性突变体。所有HA蛋白均通过哺乳动物细胞表达系统制备，确保糖基化修饰真实性。

突变在Viet04 HA中改变RBD和融合域的动态特性

研究人员首先考察了Imai等人报道的越南株适应性突变（N158D、N224K、Q226L、T318I）对HA动态的影响。中性pH条件下，突变体受体结合位点（Receptor Binding Site, RBS）的130环和220环动态性显著增加，这与晶体结构显示的受体结合口袋增宽1.5?的结果一致。值得注意的是，位于HA2融合亚基的T318I突变使融合肽（HA2 1-8）和A螺旋（HA2 34-54）动态性降低，表明异亮氨酸取代增强了该区域的疏水相互作用。

突变在Viet04 HA中稳定HA2的激活动力学

在接近融合阈值的酸性条件下（WT pH 6.1，突变体pH 5.9），野生型HA在融合肽和HA1/HA2界面表现出显著的动态增加。相比之下，突变体在这些区域的动态变化明显减弱，特别是在包含T318I位点的F'结构域，即使达到聚集阈值时融合肽释放仍受限。这表明Viet04突变体通过“锁定”融合肽邻近区域来实现酸稳定性提升。

突变在Indo05 HA中影响中性pH下HA1/HA2界面的动态

对印尼株的研究揭示了不同的稳定机制。其中性pH动态谱显示，位于HA1/HA2界面的H110Y突变通过增强与相邻原体C螺旋顶端（HA2 74-80）的氢键网络，显著稳定了该区域动态。与Viet04不同，Indo05突变体的RBS动态变化较为有限，且融合肽区域未出现明显稳定化现象。

突变在Indo05 HA中稳定HA1/HA2界面的激活动力学

酸性条件激活实验表明，Indo05突变体在C螺旋顶端（邻近H110Y突变位点）表现出显著保护效应，提示其通过限制头部结构域解离来实现稳定化。与Viet04突变体形成鲜明对比的是，Indo05突变体的A螺旋动态性反而增强，说明两种毒株采用了不同的激活路径——Viet04侧重融合肽约束，而Indo05强化头部组装稳定性。

近期H5N1 HPAI禽-人溢出感染分离株的HA表现出相对保护的融合肽和适度降低的激活pH

对当代流行株Colo22的分析显示，其中性pH下融合肽动态性介于Viet04野生型与突变体之间，且激活pH（约5.7）接近传播适应性突变体。值得注意的是，其RBS的130环动态特征与其他毒株显著不同，呈现中等灵活度，这可能与当代毒株的受体结合特性相关。

研究结论与讨论部分指出，这项工作首次在动态层面揭示了HA酸稳定性突变的分子机制。通过比较H5与既往研究的H1、H3亚型HA，研究发现每种亚型都呈现出独特的激活动态特征：属于系统发育群1的H5和H1 HA需要协调头部结构域界面与融合肽区域的动态变化，而群2的H3 HA则呈现分阶段激活模式。更重要的是，酸稳定性突变位点与HDX-MS鉴定的动态热点高度重合，这为理解流感病毒宿主适应提供了机制性解释——适应性突变会选择性地抑制各亚型特有的动态激活区域，从而避免HA过早激活或失活。

这项研究不仅深化了对流感病毒跨种传播机制的理解，更建立了通过蛋白动态特征预测病毒进化趋势的新框架。随着H5N1病毒在全球范围内的持续进化，这种基于动态特性的分析范式将为疫苗抗原设计和疫情预警提供重要理论支撑。