基于NIR-IIb荧光比率成像的肿瘤相关中性粒细胞实时监测新方法推动癌症免疫治疗精准化

《Nature Communications》：NIR-IIb fluorescence ratiometric imaging of tumor-associated neutrophils for immunotherapy efficacy monitoring and strategy optimization

　　本研究针对癌症免疫治疗疗效评估缺乏早期动态监测工具的难题，开发了一种近红外二区b窗口（NIR-IIb）荧光比率成像纳米探针，通过特异性响应肿瘤相关中性粒细胞（TANs）标志性酶——中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）的活性变化，实现了活体内TANs免疫状态的可视化定量监测。该探针利用铒基纳米颗粒（ErNPs）与NE可切割肽段偶联的苯并[cd]吲哚半花菁染料（Bi-HCy-VPAA-Ac）构建能量转移体系，在808 nm和980 nm双通道激发下产生自校准的1532 nm荧光比率信号（F1532em, 808ex/F1532em, 980ex）。在肝癌模型（Hepa1-6/H22）中成功区分免疫治疗应答/非应答个体，为个性化治疗策略调整提供了实时可视化工具。

　　

癌症免疫治疗通过激活人体免疫系统对抗肿瘤，已成为现代肿瘤治疗的重要突破。然而，这种疗法面临着一个关键挑战：患者对相同治疗方案的响应存在显著差异，且目前缺乏有效手段在治疗早期阶段评估疗效。传统检测方法如组织活检和血液分析虽能提供部分信息，但属于侵入性操作，只能获得静态、局部的数据，难以实现实时动态监测。更棘手的是，肿瘤微环境中的免疫细胞具有高度异质性，其中肿瘤相关中性粒细胞（TANs）在不同条件下可表现为抗肿瘤的"N1"表型或促肿瘤的"N2"表型，而后者分泌的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）被认为是促进肿瘤进展的关键因子。因此，动态监测TANs中NE表达水平的变化，理论上能够反映免疫治疗的早期效果，为治疗策略调整提供关键依据。

为解决这一难题，发表在《Nature Communications》上的最新研究报道了一种创新性的近红外二区b窗口（NIR-IIb）荧光比率成像技术，实现了对TANs免疫状态的高精度、动态可视化监测。研究团队设计了一种智能响应型纳米探针（Bi-HCy-ErNPs），其核心创新在于将NE特异性可切割肽段与铒基纳米颗粒（ErNPs）有机结合，构建了双通道自校准成像体系。该探针在肿瘤微环境中遇到NE时，肽段被切割释放活性染料分子，通过荧光共振能量转移（FRET）机制显著增强808 nm激发下的1532 nm荧光信号；而980 nm激发的1532 nm信号则保持稳定作为内参，两者比值的变化可精准反映NE活性水平。

研究团队采用了多学科交叉的技术方法：通过有机合成构建NE特异性响应染料（Bi-HCy-VPAA-Ac），利用稀土掺杂技术制备核壳结构铒基纳米颗粒（NaYbF₄:Er,Ce@NaYF₄:Yb,Lu），并通过表面聚合物修饰（PMH/8Arm-PEG-NH₂/PAA/DSPE-PEG-cRGD）增强探针靶向性和生物相容性。在肝癌模型（Hepa1-6/H22）小鼠中进行了系统验证，包括体外细胞实验（N1/N2中性粒细胞、CD8⁺T细胞等）、活体成像、流式细胞术分析免疫细胞亚群等。

NE响应性验证

研究首先证实了Bi-HCy-VPAA-Ac对NE的特异性响应机制。光谱分析显示，NE切割后探针吸收峰从665 nm红移至794 nm，荧光强度增强15倍，质谱验证了切割产物Bi-HCy-OH的形成。密度泛函理论计算表明，切割后分子的最高占据分子轨道（HOMO）与最低未占分子轨道（LUMO）能级差从2.05 eV缩小至1.34 eV，增强了分子内电荷转移（ICT）效应。

纳米探针构建与表征

团队成功合成了核壳结构的ErNPs，并通过疏水作用将染料分子装载于颗粒表面。透射电镜显示清晰的晶格条纹（核层间距2.18 ?，壳层0.87 ?），X射线衍射证实α-NaYF₄/NaYbF₄晶相结构。表面修饰后探针粒径从21.68 nm增至29.69 nm，时间分辨荧光显示能量转移效率达49.65%。

体外细胞成像

在多种细胞系（N1/N2中性粒细胞、CD8⁺T细胞等）中，Bi-HCy-ErNPs仅在高表达NE的N2中性粒细胞中产生显著比率信号增强，且该效应可被NE抑制剂西维来司他（sivelestat）特异性抑制。生物透射电镜证实探针被细胞内化，荧光显微镜显示比率信号与NE抗体标记结果高度相关（R=0.84-0.98）。

活体成像与疗效监测

在肝癌模型小鼠中，免疫治疗（抗PD-L1抗体）后第8天，治疗组肿瘤区域808 nm激发的1532 nm信号显著降低，而980 nm信号稳定，导致比率信号升高8倍。免疫荧光染色证实探针信号与NE阳性TANs共定位率达81.4%，且与CD8⁺T细胞/M1型巨噬细胞变化趋势相反。长期监测显示比率信号与肿瘤体积/重量呈负相关，流式细胞术证实治疗组TANs比例下降至5.54%（非治疗组23.5%）。

个体化治疗指导

研究进一步展示了探针在个体分层中的临床应用潜力。通过NIR-IIb比率成像将荷瘤小鼠分为应答组（低NE信号）与非应答组（高NE信号），并对非应答组调整治疗方案（联合抗CTLA-4抗体）。成像显示调整组比率信号随时间逐渐升高，肿瘤抑制效果显著改善，生存率提升。组织学分析（H&E/TUNEL/Ki-67染色）和免疫细胞流式分析验证了治疗响应差异。

该研究的创新性在于首次将NIR-IIb荧光比率成像技术应用于TANs免疫状态的动态定量监测，解决了传统成像技术穿透深度不足、定量精度差的问题。通过双通道自校准机制有效消除了探针分布不均、组织衰减等干扰因素，实现了对免疫治疗应答的早期、准确评估。更重要的是，该技术为临床提供了一种非侵入性的个体化治疗指导工具，使医生能够根据实时免疫状态动态调整治疗方案，有望显著提高癌症免疫治疗的响应率和患者生存获益。未来，这种成像策略可进一步拓展至其他免疫细胞亚群的功能监测，推动精准免疫治疗的发展。