胞外蛋白OsCPIP8通过双重保护机制抑制病原蛋白酶并激活水稻免疫

《Nature Communications》：The apoplastic protein OsCPIP8 confers dual protection by inhibiting pathogenic protease and activating rice immunity

　　本研究针对水稻白叶枯病菌(Xoc)分泌的半胱氨酸蛋白酶XoCysP1破坏水稻免疫的机制展开研究。研究人员发现水稻胞外半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白OsCPIP8不仅能够抑制XoCysP1对防御蛋白OsXIP2的降解，还能被受体激酶OsRLK8和OsSERK2识别激活免疫反应，揭示了植物在胞外空间抵御病原菌侵染的双重防御新机制，为作物抗病育种提供了新策略。

　　

在水稻与病原菌的长期博弈中，胞外空间（apoplast）作为植物与病原菌相互作用的第一道防线，扮演着至关重要的角色。这一充满细胞壁和细胞间隙的特殊区域，不仅是营养物质交换的通道，更是免疫信号分子（如活性氧、钙离子等）激烈交锋的战场。病原菌为了成功侵染宿主，会向胞外空间分泌多种水解酶，其中包括一类重要的武器——半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteases）。这些酶能够降解植物细胞壁成分和防御蛋白，为病原菌的定殖和扩展铺平道路。然而，植物如何特异性识别并反击这些病原蛋白酶的攻击，特别是在胞外空间这一关键区域，其分子机制尚不清晰。

面对这一科学问题，山东农业大学丁新华教授团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。研究人员以水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc）为模型，发现了一种名为XoCysP1的病原菌分泌的半胱氨酸蛋白酶。该蛋白酶能够靶向降解水稻胞外的一种防御蛋白OsXIP2（Xylanase Inhibitory Protein 2），从而削弱水稻的免疫防御能力。更有趣的是，水稻进化出了相应的反击策略——分泌一种半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白OsCPIP8（cysteine protease inhibitory protein）。OsCPIP8不仅能直接抑制XoCysP1的酶活性，保护OsXIP2免遭降解，其本身还能被水稻细胞膜上的受体激酶OsRLK8（receptor-like kinase 8）及其共受体OsSERK2（Somatic Embryogenesis Receptor Kinase 2）识别，进而激活经典的PTI（Pattern-Triggered Immunity）免疫反应。这一发现揭示了植物胞外蛋白酶抑制蛋白具有“酶活性抑制”和“免疫激活”的双重功能，为理解植物与病原菌在胞外空间的“攻防战”提供了新视角。

为阐明OsCPIP8的双重功能机制，研究人员综合运用了多种关键技术。他们通过质谱分析鉴定了水稻与Xoc互作过程中的胞外蛋白质组。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了OsXIP2、OsCPIP8、OsRLK8和OsSERK2的基因敲除（KO）和过表达（OE）水稻株系。通过酵母双杂交（Y2H）、免疫共沉淀（Co-IP）、体外pull-down、双分子荧光互补（BIFC）和荧光素酶互补成像（LCA）等技术验证了蛋白质间的相互作用。通过体外蛋白酶降解实验和体内瞬时表达实验分析了XoCysP1对OsXIP2的降解作用及OsCPIP8的抑制功能。利用活性氧（ROS）爆发检测、胼胝质沉积及防御相关基因表达分析评估了免疫反应。通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的瞬时转化技术在本氏烟（Nicotiana benthamiana）中进行蛋白亚细胞定位和互作验证。

Apoplast-localized XoCysP1 positively regulates Xoc virulence via cysteine protease activity

研究人员首先从Xoc侵染的水稻叶片中提取胞外蛋白，通过质谱分析鉴定出一个含有信号肽的分泌型半胱氨酸蛋白酶XoCysP1。基因敲除实验表明，缺失XoCysP1的Xoc菌株（R_ΔXoCysP1）致病性显著降低，而回补菌株（CR_ΔXoCysP1）能恢复致病力。点突变实验（C75A）证实XoCysP1的催化活性位点Cys⁷⁵对其致病性至关重要。分泌实验证明XoCysP1能被分泌到胞外空间。

XoCysP1 is involved in the degradation of the apoplastic defense protein OsXIP2

通过酵母双杂交筛选和质谱分析，研究人员发现XoCysP1与水稻胞外防御蛋白OsXIP2相互作用。体内外实验（Co-IP, pull-down, BIFC, LCA）均证实了二者的直接结合。功能实验显示，过表达OsXIP2增强水稻对Xoc的抗性，而敲除OsXIP2则使水稻更感病。亚细胞定位证实OsXIP2定位于胞外空间。进一步的降解实验表明，XoCysP1依赖其蛋白酶活性降解OsXIP2，而催化失活突变体（XoCysP1^C75A）则丧失此功能。

OsCPIP8 inhibits XoCysP1-mediated OsXIP2 degradation

为了解水稻的反击机制，研究人员从胞外蛋白质组中鉴定出一个半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白OsCPIP8。互作实验表明OsCPIP8能特异性结合XoCysP1。OsCPIP8过表达增强水稻抗病性，而其敲除则导致感病性增强。OsCPIP8同样定位于胞外空间。功能挽救实验显示，OsCPIP8能有效抑制XoCysP1对OsXIP2的降解，且这种抑制作用具有剂量依赖性。此外，OsCPIP8介导的抗病性依赖于XoCysP1的存在。

OsCPIP8 induces rice immunity in the apoplast

除了抑制蛋白酶活性，研究人员发现外源施加重组的OsCPIP8蛋白能诱导水稻产生典型的免疫反应，包括活性氧（ROS）爆发、防御相关基因OsPR2和OsPR3的上调表达。在OsCPIP8过表达植株中，这些免疫响应更为强烈，而其敲除植株则响应减弱。

OsCPIP8 interacts with the extracellular domains of the receptor-like kinase OsRLK8 and the co-receptor OsSERK2

为了阐明OsCPIP8激活免疫的机制，研究人员通过免疫沉淀偶联质谱（IP-MS/MS）和生物信息学分析，推测受体激酶OsRLK8可能是OsCPIP8的潜在受体。实验证实OsRLK8定位于细胞膜。进一步的互作分析显示，OsCPIP8与OsRLK8的胞外域（OsRLK8^Ex）直接结合，但不与其胞内激酶区结合。同时，OsRLK8^Ex能与共受体OsSERK2的胞外域（OsSERK2^Ex）相互作用，OsCPIP8也能直接与OsSERK2^Ex结合，提示三者可能在细胞膜上形成复合物。

OsCPIP8 induces rice immunity requiring OsRLK8 and OsSERK2

功能验证实验表明，OsCPIP8诱导的免疫反应（包括抗病性增强和ROS爆发）在OsRLK8或OsSERK2敲除植株中显著减弱，而在OsRLK8过表达植株中增强，证明OsCPIP8触发的免疫依赖于OsRLK8和OsSERK2。重要的是，过表达OsCPIP8、OsXIP2或OsRLK8并未对水稻的主要农艺性状（如株高、千粒重）产生负面影响，表明通过操纵这些基因提高抗病性具有应用潜力。

该研究最终构建了一个双层次防御模型：当Xoc侵染时，其分泌的XoCysP1蛋白酶降解水稻的防御蛋白OsXIP2；作为反击，水稻分泌OsCPIP8抑制XoCysP1的活性，保护OsXIP2。同时，OsCPIP8被细胞膜上的受体复合物OsRLK8/OsSERK2识别，激活PTI免疫反应，从而协同增强水稻对病原菌的抗性。这项研究不仅揭示了植物胞外半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白具有酶活抑制和免疫激活的双重新功能，而且发现OsCPIP8在提高抗病性的同时不影响作物生长，打破了抗病与产量间常见的权衡关系，为开发新一代绿色农药和培育持久抗病作物提供了重要的理论依据和基因资源。