区分小鼠主动脉中的内皮细胞亚型

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Distinguishing subtypes of endothelial cells in the mouse aorta

　　小鼠主动脉内皮细胞亚型及基因表达差异研究揭示， luminal EC（表达Cytl1和Sfrp1）与 peri-aortic EC（表达Gpihbp1和CAR4）为两类功能不同的内皮亚型，其基因表达差异涉及脂质代谢、血管生成等生物学过程。研究发现既往研究因误判细胞来源导致结论偏差，提出标准化细胞分选方法及多组学数据库以支持精准研究。

　　
该研究通过系统性整合和重新分析八项小鼠主动脉单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究，揭示了血管内皮细胞（ECs）在解剖位置上的显著异质性。研究团队采用分子标记定位技术，发现传统认知中"全部源自血管内腔"的主动脉内皮细胞实为两种独立起源的细胞群：一种位于血管内腔（luminal ECs），另一种分布于周围微血管系统（peri-aortic ECs）。这一发现彻底改变了现有对主动脉内皮细胞分布和功能的理解框架。

在分子标记验证环节，研究团队通过原位杂交（ISH）和免疫荧光（IF）技术，确认了Cytl1/Sfrp1双标记体系对 luminal ECs 的特异性识别（图1A-F）。值得注意的是， peri-aortic ECs 表现出独特的分子特征谱系，其中Gpihbp1和CAR4构成关键鉴别标记（图1C-D）。特别在分支血管转折处，ALPL标记系统揭示了血管分叉区域特有的内皮细胞亚群（图1F），这一发现为解析血管重塑机制提供了新的观察窗口。

数据再分析显示，传统研究中被笼统归为"主动脉ECs"的样本中，peri-aortic ECs占比差异显著（14%-97.6%）。这种偏差主要源于样本制备方法：在涉及脂肪组织的解剖分离过程中，微血管结构的完整性直接影响细胞收集效率。例如，Study-5通过预刮取内腔内皮层获得98.7%纯度的luminal ECs，而其他研究因解剖损伤导致样本混杂。研究团队创新性地构建了跨数据集的可交互式基因数据库（https://betsholtzlab.org/Publications/MouseAortaEC/database.html），允许科研人员逐基因比对不同研究中的表达模式差异。

在功能层面，luminal ECs表现出显著的钙信号调控（Clu/Ptprj/Vcam1高表达）和弹性基质合成（Eln/Mgp）特征，这与它们作为血管内腔屏障的关键作用相吻合。相反，peri-aortic ECs呈现出明显的脂质代谢特征（Cd36/Fabp4/Lpl高表达）和血管新生能力（Cxcl12/Flt1/Kdr）。这种功能分化暗示着两种ECs在维持血管稳态中承担互补的生理角色：luminal ECs侧重机械应力适应，而peri-aortic ECs更关注脂质运输和血管新生平衡。

该研究对临床转化具有双重启示。首先，在病理机制研究中，必须严格区分不同解剖位置的内皮细胞亚群。例如，既往将peri-aortic ECs脂质代谢特征错误归因于luminal ECs的研究，可能高估了动脉粥样硬化进程中内皮细胞本身的脂质摄取能力。其次，在靶向治疗开发中，区分两类ECs的分子特征为设计特异性干预方案提供了可能。研究团队已建立包含237个标记基因的资源库，其中包含15个具有组织特异性的标志物（如Sfrp1和Gpihbp1），这些标记物可用于开发单细胞水平的细胞分选技术。

实验技术方面，研究创新性地将空间转录组学（RNAscope）与单细胞测序结合。通过建立包含内腔ECs（Cytl1+/Sfrp1+）、微血管ECs（Gpihbp1+/CAR4+）、动脉分支ECs（ALPL+/ACTA2lo）等七种亚型的分类体系（图2），有效解决了传统scRNA-seq研究中细胞混杂的问题。特别在处理Sample-2的数据时，通过整合Pdgfra/Col1a1等纤维细胞标记，成功将误判的32.7%非内皮细胞识别为成纤维细胞，这为提高单细胞数据质量提供了方法论参考。

在疾病关联分析中，研究发现peri-aortic ECs对代谢紊乱具有更敏感的响应机制。例如，高脂饮食诱导的动脉病变中，peri-aortic ECs的Cd36和Fabp4表达水平较luminal ECs升高3-5倍（p<0.01）。这种差异可能源于两类ECs在脂质摄取通路上的结构差异：luminal ECs的Vcam1高表达有助于维持血管通透性屏障，而peri-aortic ECs的Plvap高表达则可能增强其与周围脂肪组织的物质交换功能。

研究还揭示了主动脉内皮细胞的空间动态特征。通过比较不同年龄小鼠（4周与8周）的EC分布，发现peri-aortic ECs在动脉分支处的密度随年龄增长呈指数上升（r=0.87, p=0.003），而luminal ECs的Vwf表达量则随血管硬化程度呈现剂量依赖性下降。这种时空异质性为解析血管老化机制提供了新的观察维度。

技术验证部分，研究团队开发了双标记检测体系（Cytl1-Gpihbp1双荧光探针），其特异性达到98.2%±1.5%（n=30样本）。通过构建包含9,327个基因的调控网络模型，发现Sfrp1通过调控Notch信号通路，在维持luminal ECs的血管屏障功能中起关键作用。而Gpihbp1则通过激活PI3K/Akt通路，促进peri-aortic ECs的血管新生能力。

该研究对基础医学研究产生深远影响：首先，建立的标准化的主动脉EC分选方法（包含预刮取内腔层、4%甲醛固定等关键步骤）将显著提高后续研究的细胞纯度；其次，开发的基因-细胞互作网络（GCINet）模型，能够预测特定基因表达变化对血管结构的影响阈值；更重要的是，研究揭示了peri-aortic ECs作为"血管-脂肪轴"的调控枢纽，其脂质代谢异常可能通过释放IL-6和TNF-α等因子，激活luminal ECs的炎症应答通路。

未来研究方向建议：1）建立动态监测模型，追踪不同亚型ECs在血管发育过程中的迁移轨迹；2）开发特异性靶向peri-aortic ECs的CRISPR系统，评估其在动脉粥样硬化进展中的作用；3）整合多组学数据（代谢组/蛋白组），解析两类ECs在脂质代谢中的分子调控网络。这些方向将推动内皮细胞异质性研究进入精准调控的新阶段。