《Applied Materials Today》：Exploring boronate-appended hyperbranched amino-functionalized dendrimer-empowered sensors for the potential recognition of FSH in age-categorized human plasma samples
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本研究开发了氨基功能化多硼酸树状大分子（Af-BAD），用于阻抗式传感器检测FSH，检测限低至4.01 fg/mL，线性范围广，成功应用于血清样本，并与ELISA方法比较验证其有效性。
Sathyadevi Palanisamy | Priya Vijayaraghavan | Yen-Yun Wang | Yi-Wen Yao | Bo-Cheng Huang | Wen-Liang Chen | Chai-Lin Kao | Shyng-Shiou F. Yuan | Yun-Ming Wang
台湾师范大学化学系，台北11677
摘要
硼酸可作为理想的糖类受体，因为它们对二醇具有很高的亲和力，并且在水介质中反应时容易形成环状硼酸酯。本文首次介绍了一种亲水性氨基功能化的硼酸树状大分子（Af-BAD），其在检测促卵泡激素（FSH）方面表现出显著增强的敏感性。在本研究中，新合成的Af-BAD被涂覆在金基底上，制备成了阻抗型传感工作电极。通过测量电化学装置中的电荷转移电阻，评估了Af-BAD涂层对金芯片的影响、FSH识别的传感性能、灵敏度和稳定性。阻抗测量在pH 7.4的条件下，使用[Fe(CN)63-/[Fe(CN)64-氧化还原指示剂进行。随着FSH浓度从25 fg/mL增加到100 pg/mL，电荷转移电阻随之增加。该传感器显示出良好的灵敏度，计算出的检测限为4.01 fg/mL，并且具有可接受的线性关系。同时，也成功地对血清样本进行了实际应用测试。此外，还测试了硼酸树状大分子对其他竞争性糖蛋白和单糖的耐受性。本研究还使用Af-BAD修饰的传感器和临床常用的ELISA方法，比较了女性口腔癌患者与正常对照组的人体血浆FSH水平。通过对硼酸材料的深入理解，开发出了这种“氨基功能化多硼酸树状大分子”，作为高度选择性的FSH检测结合物。
引言
重组人促卵泡激素在生殖医学中至关重要，用于激素治疗、体外受精和精子发生治疗[1]。糖蛋白占人体总蛋白质的50%以上，因此在免疫反应、分子检测、细胞内和细胞间信号传导等方面发挥重要作用[2]。然而，由于存在许多干扰因素，糖蛋白的诊断价值通常受到限制，这给糖蛋白的捕获带来了很大困难。因此，对糖蛋白的选择性识别具有很高的需求[3]。
近年来，基于硼酸的亲和材料受到了越来越多的关注，因为硼酸可以容易地与糖蛋白中的1,2-二醇和1,3-二醇单元结合，在碱性水介质中形成5元或6元环状酯[2]。在酸性条件下，环状酯的形成会解离，且不会改变糖蛋白中碳水化合物单元的结构，因为这种反应是可逆的[3]。最常用的硼酸基传感器采用胺单元，在中性pH下与硼酸反应时形成硼酸酯[4]。这一独特性质使得可以利用硼酸基功能团设计出复杂的传感器系统[4]。
像抗体或抗原这样的生物分子在识别结合目标时涉及多种结合相互作用[5][6][7]。硼酸被用于构建各种电化学传感器，其效果取决于目标结合对电位/电流变化的影响[8]。高度分支的、分散的大分子和树状大分子被用作结构支架，以生成多价结合位点。在生理条件下，发现单硼酸分子对不同糖单元的结合亲和力不同[9]。引入了两个硼酸基团以识别碳水化合物单元中的另一对二醇。与其他单糖单元相比，双硼酸-碳水化合物单元的结合强度（以结合常数衡量）更强[8]。因此，本研究专注于开发一种新的亲水性“氨基功能化多硼酸树状大分子”，用于FSH的检测[10]。
树状大分子被称为软大分子[9]，可以通过电子转移介质、适当的封装或共价结合来合理调节，以促进活性电子转移过程[11]。由于其溶解性，高度可溶的超分支树状大分子被选为构建FSH反应性传感器的聚合物单元[10]。这种水溶性树状大分子的强结合亲和力有助于功能化材料与糖蛋白中的唾液酸轻易螯合，从而实现均匀富集[11]。开发电化学生物传感器的最有前景的策略之一依赖于不可逆的固定化（硼酸-糖蛋白单元）[12][13]。通过在硼酸树状大分子表面修饰胺单元，我们旨在显著增加FSH的识别位点。多重相互作用将提供更高的结合亲和力，成功修饰的硼酸功能化电极可通过碳水化合物单元的唾液酸结合来检测FSH[14][15]。唾液酸存在于糖蛋白碳水化合物单元的寡糖链中，位于糖蛋白非还原端的末端[16]。
生物识别成分如酶和抗体对于激素的电化学免疫传感是必需的[17][18]。这些技术能够追踪常规溶液和实际生物流体（如血液、血清、血浆、唾液和尿液）中的激素[19]。然而，在本研究中，通过创建一种特异性检测碳水化合物单元末端唾液酸的分子探针，我们尝试直接在人体内检测FSH，而无需使用抗体。氨基功能化树状大分子中的硼酸能够特异性地靶向唾液酸，从而直接帮助识别FSH，如图1所示。
材料与方法
11-巯基十一烷酸（11-MUA，95%）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺（EDC，商业级）、2-N- morpholinoethanesulfonic acid（MES）缓冲液、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，≥98%）以及电解质如铁氰化钾（K3[Fe(CN)6]和铁氰化钾（K4[Fe(CN)6）从Sigma-Aldrich/Merck公司购买。人促卵泡激素（hFSH）抗体和重组人FSH蛋白也进行了相关准备。
结果与讨论
在本研究中，我们首次展示了利用多重相互作用机制的硼酸树状大分子来提高FSH目标的特异性捕获。为了在生理条件下工作，开发了一种水溶性氨基功能化的硼酸树状大分子作为材料模型。Af-BAD的制备方法类似于之前报道的方法[24]。通过多种光谱表征技术分析了Af-BAD的结构，包括1H NMR、13C NMR等。
结论
为了构建可靠的FSH结合物阻抗生物传感器，在电极表面装饰了含有层状Af-BAD结构的金电极。总体而言，作为水溶性硼酸功能化材料的Af-BAD在捕获特定糖蛋白方面显示出广泛的应用潜力。FSH生物传感器具有宽线性范围，检测限低至4.01 fg/mL。此外，已经验证了Af-BAD带来的灵敏度和稳定性提升。
Sathyadevi Palanisamy：撰写 – 审稿与编辑、原始稿撰写、验证、方法学研究、数据分析、概念构建。
Priya Vijayaraghavan：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法学研究、数据分析、概念构建。
Yen-Yun Wang：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法学研究、数据分析。
Yi-Wen Yao：验证、数据分析。
Bo-Cheng Huang：验证、数据分析。
