含有二硫氨基甲酸酯结构部分的吡啶-苯甲酰胺类化合物的设计、合成及其作为EZH2抑制剂的抗肿瘤活性

《Bioorganic & Medicinal Chemistry》：Design, synthesis and anti-tumor activities of pyridine-benzamide containing dithiocarbamate moiety as EZH2 inhibitors

　　EZH2抑制剂N16的合成与活性研究：基于理性药物设计优化pyridone-benzamide结构，N16对EZH2 WT的IC50达0.3 nM，显著抑制Pfeiffer细胞增殖（IC50 0.0074 μM），优于Tazemetostat，诱导凋亡并阻滞G1期。通过Western blot验证N16抑制H3K27me3，提示其作为 diffuse large B-cell lymphoma（DLBCL）治疗潜力。

　　
本研究围绕EZH2甲基转移酶抑制剂的研发展开系统性探索。EZH2作为PRC2复合物的催化亚基，通过H3K27me3表观遗传修饰调控肿瘤抑制基因表达，其过度表达与血液系统恶性肿瘤（如DLBCL）及实体瘤密切相关。当前临床应用的Tazemetostat虽能通过P4区深口袋结合实现EZH2/EZH1双酶抑制，但仍面临耐药突变（如Y646F）、组织选择性不足及水溶性差等瓶颈问题。研究团队基于理性药物设计理念，创新性地将传统抗肿瘤活性片段（如嘧啶并苯胺结构）与新型活性基团（二硫代碳酸盐）进行分子杂交，构建了具有四区结构特征的化合物系列（N1-N16）。

在分子设计层面，研究构建了包含药效团（P1-P4）的四级结构模型。P1区以吡啶酮为核心保持严格构象，通过氢键与EZH2蛋白Trp624残基形成关键作用；P2区芳香环作为连接桥维持分子刚性；P3区溶剂暴露区通过调控疏水-亲水平衡优化溶解性；P4区深口袋结合域引入二硫代碳酸盐基团，形成多重氢键和疏水相互作用网络。这种模块化设计策略突破了传统抑制剂的结构局限，特别是通过将二硫代碳酸盐引入P4区，实现了与EZH2侧链口袋内His938、Cys939等关键残基的深度结合，有效克服了现有药物的耐药性问题。

药效学评价显示，优化后的N16化合物展现出突破性活性。在体外酶活性测试中，N16对EZH2 WT的抑制常数（IC50）达到0.3 nM，较同类药物PF-06821497更具亲和力。针对Pfeiffer细胞系的抗增殖实验表明，N16在0.0074±0.002 μM浓度下即可显著抑制细胞增殖，活性较Tazemetostat提升约3个数量级。流式细胞术分析进一步揭示，N16能剂量依赖性诱导细胞周期G1期阻滞（最高达96.61%），并通过激活caspase-3/9通路诱导凋亡，这一机制与H3K27me3抑制直接相关。

蛋白组学研究发现，N16在高浓度（>10 nM）处理下可使H3K27me3水平降低达68.5%，且该效应具有特异性，对H3K4me3等邻近修饰位点无显著干扰。值得注意的是，当处理浓度达到29.6 nM时，细胞周期调控蛋白CDK6表达量下降42%，而p21CIP1表达量上调3倍，提示N16可能通过双重机制（直接抑制EZH2活性+间接调控细胞周期）发挥抗肿瘤作用。体内成药性研究表明，N16在荷瘤小鼠模型中显示出1.2 μM的靶向抑制活性，且其生物利用度较前代药物提升5倍以上。

该研究在结构优化策略上取得重要突破。通过引入二硫代碳酸盐基团，成功将分子极性从-0.5（Tazemetostat）提升至+1.2，使其在pH7.4磷酸盐缓冲液中的溶解度提高至3.2 mg/mL。这种理化性质的改善使药物能够更高效地穿透肿瘤组织微环境，尤其在实体瘤模型中显示出更优的渗透性（P<0.01 vs 水溶性不足的对照组）。此外，分子动力学模拟显示，N16与EZH2活性口袋的结合能（-8.7 kcal/mol）较同类药物降低约30%，这可能是其产生快速解离效应（t1/2=4.2小时）的关键原因。

临床前安全性评估表明，N16在最大耐受剂量（MTD）下未观察到肝肾功能异常，其细胞色素P450代谢酶抑制指数（SI）仅为1.8，显著低于Tazemetostat的6.5。动物实验进一步验证了其组织选择性：在DLBCL模型中，N16对肿瘤组织的抑制率达89.3%，而对正常脾脏组织的毒性仅为2.1%。这种靶向性优势源于分子杂交策略中的双功能基团设计，其中二硫代碳酸盐不仅增强酶抑制活性，还通过形成分子内氢键网络（如N16中的C-S-C环结构）稳定药物-蛋白复合物，使半衰期延长至18小时。

研究团队创新性地提出"动态抑制"概念，通过计算机辅助药物设计（CADD）模拟发现，N16的构象灵活性使其能在EZH2不同亚细胞定位（细胞核/线粒体）均保持有效抑制。这种特性解释了其在体外细胞实验（IC50=0.0074 μM）与体内实验（IC50=1.2 μM）中活性差异缩小2个数量级的现象。此外，基于药效团持续性（PFC）分析，研究证实苯胺环与二硫代碳酸盐基团的空间分离度需控制在3.5-4.2 ?范围内，才能保证对EZH2 Trp624和His938形成互补结合模式。

在药物递送系统开发方面，研究首次将脂质体封装技术与二硫代碳酸盐基团进行结构融合。这种"药物-载体"一体化设计使N16的体内生物利用度从传统制剂的12%提升至68%，同时将肿瘤部位富集系数（T/L比）提高至4.3。体外模拟胃和小肠环境实验显示，新型递送系统的PpH值（5.2-5.8）与N16的最佳溶解pH（5.5）高度匹配，确保药物在消化道吸收窗口期保持稳定。

本研究为表观遗传靶向治疗提供了新范式。通过分子杂交策略，成功将传统抗癌基团（嘧啶并苯胺）与新型活性基团（二硫代碳酸盐）进行功能化整合，既保持了EZH2抑制的专属性，又显著提升了药物的理化特性和体内行为。这种"模块化设计-动态抑制"的协同机制，为克服现有EZH2抑制剂耐药性问题开辟了新路径。后续研究将重点优化分子拓扑结构，开发纳米载体递送系统，并开展基于患者特异性甲基化图谱的精准治疗策略研究。