《Bioorganic Chemistry》：Dual-responsive SERS nanoprobe for real-time imaging of pH and ROS dynamics in wound healing
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实时监测伤口愈合微环境中pH和活性氧（ROS）动态变化的双响应SERS探针开发。通过金-银核壳纳米颗粒负载4-巯基苯甲酸和2,5-二羟基苯硫酚构建探针，实现pH（1360/1075 cm?1比率）和ROS（876 cm?1强度）的同步检测。该探针具备高灵敏度、选择性和生物相容性，成功应用于体外细胞实验和活体小鼠伤口模型，为评估炎症状态和治疗效果提供新方法。
邓汉斌|杨珊宇|吴慧文|周汉|张佩申|程少文|余法彪|王瑞
教育部应急与创伤重点实验室，海南创伤与灾难救援重点实验室，海口创伤重点实验室，海南医科大学第一附属医院，海南海口571199，中国
摘要
在伤口愈合的复杂过程中，实时动态监测微环境中的关键指标（如pH值和活性氧（ROS）可以有效评估伤口的炎症状态和治疗效果。本研究开发了一种双响应表面增强拉曼散射（SERS）探针，能够同时检测伤口愈合过程中pH值和ROS水平的变化。该探针以金-银核壳纳米颗粒（Au@Ag NPs）作为活性基底，并将4-巯基苯甲酸（4-MBA）和2,5-二羟基噻吩（DHBT）修饰为拉曼报告分子，随后用聚乙二醇和牛血清白蛋白进行包覆以提高生物相容性和稳定性。在拉曼光谱中，DHBT在876 cm?1处的峰用于指示ROS水平，而4-MBA在1360 cm?1和1075 cm?1处的强度比（I1360/I1075）反映了pH值的变化。该SERS探针表现出良好的比率响应特性、高选择性和低细胞毒性。体外SERS成像实验表明，该探针能够动态监测ROS的产生和pH值的变化，而在小鼠伤口模型中的SERS成像进一步证实了其在体内监测伤口微环境中pH值和ROS的能力。组织学分析也验证了其生物安全性。总之，本研究设计的双响应SERS探针在评估伤口愈合效果方面具有潜在的应用价值，为监测伤口微环境提供了一种新方法。
引言
伤口愈合是一个复杂但有序的生物过程，正常的伤口愈合通常需要经历止血、炎症、增殖和组织重塑等阶段[1,2]。在这些交替阶段中，伤口微环境会发生一系列生理和生化变化，这些变化对愈合过程有显著影响。其中，pH值和ROS的变化可以调节炎症反应、细胞迁移和细胞外基质（ECM）的形成，这些都是伤口愈合的关键事件[[3], [4], [5]]。具体来说，在炎症早期，中性粒细胞和巨噬细胞等免疫细胞会浸润并产生大量ROS，而局部酸化会进一步加剧组织损伤并破坏伤口微环境的稳态。如果不能及时干预，这些变化将导致炎症期延长并阻碍伤口愈合[6]。同时，局部pH值的变化，尤其是由乳酸积累和厌氧代谢引起的酸中毒，会进一步加剧组织损伤，降低酶活性，阻碍细胞增殖，并破坏ECM的沉积和重塑[7]。因此，实时精确检测pH值和ROS水平的变化对于理解伤口病理过程和评估治疗效果至关重要。
然而，传统的检测方法（如荧光探针、电化学传感器或酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒）往往缺乏捕捉这些动态变化所需的灵敏度和实时响应性[8]。这些缺点限制了它们在复杂生物组织中的应用。因此，具有极高准确性和高选择性的生物传感平台为解决这一难题提供了有希望的途径[[9], [10], [11]]。表面增强拉曼散射（SERS）由于其超灵敏度、分子特异性和多重检测能力，已成为生物分析领域的强大工具[[12], [13], [14]]。已经开发出SERS探针用于敏感检测蛋白质、核酸、小分子和微环境中的生物标志物[[15], [16], [17], [18], [19]]。然而，大多数SERS探针只能对单一分析物作出响应，无法捕捉复杂生理微环境中的协同动态[20,21]。为了克服这一障碍，研究人员探索了含有双重拉曼报告分子的比例响应SERS探针，以实现复杂生物系统中的双重目标检测和更高的可靠性[22,23]。尽管已经开发出许多用于pH值+H2O2或金属离子+pH值系统的比例响应SERS探针，但大多数仅适用于体外或细胞模型，缺乏在复杂组织微环境中的应用。此外，探针在生理条件下的不稳定性和较差的可重复性也限制了其实时监测的转化潜力[24,25]。
本文报道了一种双响应SERS纳米探针，可用于同时实时成像pH值和ROS的变化，以指示伤口愈合过程中的炎症情况（图1）。将2,5-二羟基噻吩（DHBT）和4-巯基苯甲酸（4-MBA）作为双重报告分子固定在金-银核壳纳米颗粒（Au@Ag NPs）的表面，然后进行聚乙二醇（PEG）和牛血清白蛋白包覆，制备出SERS探针[[26], [27], [28]]。DHBT作为ROS响应的拉曼报告分子，而4-MBA是一种对pH值敏感的分子，其拉曼峰强度随环境pH值的变化而变化。这种双响应SERS探针具有良好的稳定性和生物相容性，能够在广泛的pH范围内敏感地响应ROS的变化。此外，使用RAW 264.7细胞的体外实验和在小鼠伤口模型中的SERS成像均表明，该探针能够同时监测伤口微环境中的pH值和ROS的变化。
试剂和化学品
本研究中使用了三水合氯金酸（HAuCl?·3H?O，Siyi Chemical，中国）、柠檬酸钠（NaCit，Xilong Scientific，中国）、硝酸银（AgNO?，Xilong Scientific，中国）、4-巯基苯甲酸（4-MBA，Aladdin，中国）、2,5-二羟基噻吩（DHBT，Yuanye Bio，中国）、硫醇-聚乙二醇（HS-mPEG，Aladdin，中国）、牛血清白蛋白（BSA，Beyotime，中国）、Tris-HCl缓冲液（White Shark Bio，中国）和氢氧化钠（NaOH，Aladdin，中国）。使用超纯水（18.25 MΩ·cm）
SERS探针的制备和表征
为了验证双响应SERS探针的物理化学性质和形态，进行了一系列表征实验。这些实验旨在评估探针的光谱特性、纳米颗粒大小、表面电荷、稳定性、选择性和结构完整性，以确保其能够在复杂生物环境中实现pH值和ROS的比率检测。如图2a所示，记录了比较拉曼光谱
结论
总之，我们开发了一种双响应SERS探针，能够实时无创地监测伤口愈合过程中的pH值和ROS动态。将DHBT和4-MBA作为拉曼报告分子整合到PEG/BSA修饰的Au@Ag核壳纳米颗粒表面，表现出高生物相容性、稳定性和在生理条件下的双重响应性。这种探针为氧化应激和pH值在伤口愈合过程中的变化提供了新的生化解释。
CRediT作者贡献声明
邓汉斌：撰写——原始草稿、资源获取、方法学设计、实验实施、数据分析、概念构建。杨珊宇：撰写——原始草稿、方法学设计、实验实施、数据分析。吴慧文：方法学设计、实验实施、数据管理。周汉：软件开发、实验实施、数据分析。张佩申：软件开发、资源获取、实验实施、概念构建。程少文：撰写——审稿与编辑、项目监督、资金筹集、数据管理
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本工作得到了海南省科学技术专项资金（编号：ZDYF2024SHFZ104、ZDYF2025SHFZ049、ZDKJ2021038）、国家自然科学基金（编号：22564013、82560446、22264013）、海南省临床医学中心及海南省院士创新平台、海南医科大学学术提升支持计划（编号：XSTS2025091、XSTS2025120）的财政支持。
