《Bioorganic Chemistry》：Characterization of the interaction between diclofenac sodium and human serum albumin based on network pharmacology, electrochemical analysis, fluorescence spectroscopy, and computational simulations
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本研究通过整合网络药理学、电化学实验及计算模拟，揭示了邻苯二甲酸二氯苯甲酰酯（DIC）诱导神经毒性的分子机制。发现DIC与HSA形成高亲和力1:1复合物（结合常数1.18±0.06×10^5 M?1），并抑制HSA酯酶活性，分子动力学和圆二色谱结果证实结构稳定性降低，为评估DIC的环境与健康风险提供了新策略。
田淼淼|黄新燕|周燕|李西婷|曾玉静|卢志莉|迟宝珠
南昌大学化学与化学工程学院，中国江西省南昌市330031
摘要
来自药品和个人护理产品（PPCPs）的新兴污染物在废水中被广泛检测到，这些污染物与多种潜在的健康危害相关。其中，双氯芬酸钠（DIC）已在多个地点的废水样本中被检测到。因此，为了研究DIC的神经毒性分子机制，本研究采用了结合实验和计算模拟的多技术框架。网络药理学确定人血清白蛋白（HSA）是DIC诱导神经毒性的关键靶点。基于这一发现，后续研究旨在阐明HSA与DIC之间的相互作用。电化学实验表明，DIC与HSA形成了一个电不活性的复合物，该复合物的结合比为1:1，亲和力很强，结合常数为1.18 ± 0.06 × 10^5 M^-1。酯酶活性测定显示，DIC能够竞争性地抑制HSA的酯酶活性。计算模拟进一步表征了结合机制。分子对接显示，DIC与HSA的I位点结合，其苯环中的π电子在结合过程中起着关键作用。分子动力学变化与实验结果一致，表明结构稳定性降低。本研究为评估环境污染物对健康和生态系统的风险提供了创新策略。
引言
水对地球上的所有生命都至关重要，但近年来，水生环境中新兴污染物（ECs）的增加日益引起关注[1]。ECs，特别是药品和个人护理产品（PPCPs），由于其伪持久性和生物累积潜力，威胁着水生生态系统和人类健康[2]。PPCPs主要来源于废水和污水处理设施的排放以及农业应用[3]。在PPCPs中，双氯芬酸钠（DIC）及其活性代谢物双氯芬酸（DCF）尤其值得关注，因为它们具有环境持久性和潜在的生态影响[4]。在中国、越南、新加坡、马来西亚和西班牙等地区的地表水样本中检测到了高浓度的DIC和DCF[5]。在东南亚的污水处理设施中分析了药品浓度，结果显示DIC的平均浓度相对较高[6]。
欧盟最近将DIC列为优先污染物[7]。DIC的低生物降解性、高极性和水溶性阻碍了其在传统废水处理系统中的完全去除[8]。在废水处理厂中，DIC的去除效率仅为21%–40%[9]。实验数据表明，DIC具有持久性，倾向于残留在出水中[9]。因此，它经常残留在出水中并进入水生生态系统。DIC在水生环境中的普遍存在导致人类通过饮用水和水生食物链长期暴露于低剂量下[10]。越来越多的证据表明，即使在这种暴露水平下，也可能产生潜在的不良影响[11,12]。与DIC相关的最常见的不良反应是胃肠道黏膜损伤和肝毒性/肾毒性[13]。DIC还可能引起小脑相关的不良影响，如抽搐、共济失调、幻觉和意识丧失[14]。在动物模型的中枢神经系统发育期间暴露于DIC会导致多种神经和神经解剖学异常[15]。
尽管有证据表明DIC具有神经毒性，但其神经毒性的确切途径尚未得到全面研究。阐明药物诱导神经毒性的分子机制的研究方法包括荧光光谱[16]、热力学分析[17],[18],[19],[20]、电化学方法[21]等。本研究整合了网络药理学、电化学方法、荧光光谱和计算模拟，建立了一种从靶点预测和功能验证到计算分析的综合性方法。这种综合方法阐明了DIC诱导神经毒性的分子机制。
首先，使用网络药理学确定了关键蛋白质靶点。然后，通过电化学和荧光技术以及计算模拟（包括二元和三元系统）分析了关键靶点与DIC之间的相互作用。这项研究有助于更深入地理解DIC的神经毒性机制，并支持对其对公共健康和生态系统可能危害的评估。此外，这项工作为合理和安全地使用DIC进行临床应用提供了科学依据。
材料与试剂
双氯芬酸钠（p-硝基苯乙酸，p-NPA）、HSA（目录编号H856832，纯度>96%）和位点标记物（洋地黄毒苷、布洛芬和苯丁唑酮）购自Macklin Biochemical有限公司（中国上海）。用于荧光测量的磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4，0.1 M）和含有0.1 M KCl的PBS用于电化学测量，均配制为标准溶液。DIC溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，而HSA溶解在超纯水中。
DIC毒性的初步网络评估
从PubChem数据库中获得了DIC的SMLIES编号。ProTox 3.0数据库的分析结果预测，DIC具有神经毒性，预测的毒性水平为3，概率为0.83（表S2）。这种神经毒性的预测为探索DIC诱导神经毒性的潜在机制奠定了基础。
DIC诱导神经毒性靶点的鉴定
在本研究中，从SuperPred和CTD数据库中检索到1391个DIC靶点，其中3008个为神经毒性靶点。
结论
本研究阐明了DIC诱导神经毒性的分子机制，特别关注其与核心靶点的相互作用。HSA首次被确定为DIC诱导神经毒性的核心靶点。电化学分析证实形成了一个非电活性的1:1 HSA-DIC复合物，结合常数为1.18 ± 0.06 × 10^5 M^-1。荧光光谱显示，DIC与HSA之间的强相互作用引发了构象和功能变化。
作者贡献声明
田淼淼：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，资源获取，方法学，数据分析。黄新燕：撰写 – 审稿与编辑，验证，软件使用。周燕：撰写 – 审稿与编辑，验证，软件使用。李西婷：数据管理。曾玉静：撰写 – 审稿与编辑，验证。卢志莉：数据可视化。迟宝珠：撰写 – 审稿与编辑，验证，项目监督，资源获取，资金申请。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
国家自然科学基金（编号：22064012）。江西省自然科学基金（编号：20242BAB25202）。江西省研究生创新专项基金（编号：YC2025-S292）。南昌大学实验室大型仪器开放共享与自制设备研究项目（编号：NCUSSC-202523）。
