一种环状RNA circeIF4G3的鉴定及其功能特性分析：该RNA是米鱼（Miichthys miiuy）先天免疫系统的负调控因子

《Developmental & Comparative Immunology》：Identification and functional characterization of a circular RNA circeIF4G3: a negative regulator of innate immunity in miiuy croaker ( Miichthys miiuy)

　　环状RNA circeIF4G3通过抑制抗病毒基因和炎症因子表达，同时抑制细胞增殖和存活，揭示其在草鱼先天性免疫中的负调控作用，为鱼类环状RNA免疫调控机制研究提供新思路。

　　

崔艳秋|陶雅琪|徐天军|孙宇娜

上海海洋大学渔业与生命科学学院鱼类分子免疫学实验室，中国上海

摘要

近年来，环状RNA（circRNAs）独特的环状结构受到了广泛关注和研究。这些没有编码功能的RNA分子在哺乳动物体内构建了一个复杂的调控网络，影响着许多生物过程的进展。这一发现为理解基因组的功能开辟了新的视角。然而，环状RNA在鱼类中的强大调控作用仍不清楚。我们发现了一种新的环状RNA，并将其命名为circeIF4G3。通过qPCR和双荧光素酶检测，我们发现circeIF4G3能够减少抗病毒基因和炎症因子的产生。我们还发现circeIF4G3同时抑制细胞增殖并降低细胞存活率。这些结果表明，circeIF4G3不仅参与米鱼（miiuy croaker）的先天免疫，还在其中发挥抑制作用。这一发现为更深入地理解米鱼的免疫调控机制提供了新的研究方法。本研究丰富了硬骨鱼类先天免疫中非编码RNA的调控网络，并为研究环状RNA在硬骨鱼类先天免疫中的作用奠定了基础。

引言

模式识别受体（PRRs）在先天免疫系统中起着关键作用，负责识别和应对病原体及其他外来物质。一旦PRRs识别到外来物质或受损细胞，它们会激活免疫系统的其他成分，从而引发适当的免疫反应。这些PRRs能够快速识别与各种病毒病原体相关的分子模式（PAMPs）。PRRs包括TLRs、RLRs、NLRs、ALRs和CLRs。它们识别并响应病原体和损伤信号，最终触发机体对病毒和细菌的防御反应（Magnadóttir B, 2006; Tang et al., 2012）。作为PRRs的一部分，TLRs和NLRs对抗病毒和抗菌先天免疫至关重要（Liao et al., 2021; Kumar et al., 2011）。TLR是一种位于细胞膜表面的单跨膜蛋白，能够广泛识别细菌和病毒的核酸成分，从而激活机体产生免疫反应。细胞质中的Toll/IL-1受体（TIR）的TIR结构域是TLR信号通路激活的来源，它与TIR结构域内的MyD88相互作用。多种信号分子，如MyD88、TIRAP/TRIF、IRAKs、TRAF6、MAPKs、NF-κB和IRFs，参与Toll样受体（TLR）信号通路（Sun et al., 2020; O’Neill and Bowie, 2007; Caruso et al., 2014）。NLRs作为PRRs之一，也在先天免疫反应中发挥重要作用。NLRs识别细胞质中的某些病原体分子或宿主诱导的损伤信号，从而引发先天免疫反应。NOD1和NOD2是由细菌肽聚糖成分激活的NLRs。激活后，可触发多种信号通路，如NF-κB和MAPK，可能导致细胞凋亡（Xu et al., 2018; Kawai et al., 2009; Fitzgerald et al., 2020）。近年来，鱼类NLR信号通路取得了显著进展，研究表明NLR在抗菌和抗病毒免疫反应中起着重要作用。尽管TLRs和NLRs是先天免疫反应的重要组成部分，但它们的调控分子仍需进一步探索。作为天然免疫调节因子调节鱼类先天免疫反应的环状RNA的研究仍需扩展。

非编码的单链环状RNA在多种物种中都是高效的调控因子，如病毒、植物和哺乳动物。与线性RNA不同，环状RNA没有5'帽或3' poly(A)尾。环状RNA通过共价键形成闭合环结构，对核酸外切酶不敏感，这种独特结构赋予了它们高度稳定性（Liu et al., 2019; Han et al., 2018）。最初，由于基因转录和剪接错误，仅发现了极少量的环状RNA。环状RNA是由逆转录剪接产生的mRNA前体，下游剪接受体与上游剪接供体连接形成共价闭合环结构（Ishikawa et al., 2009; Han et al., 2016; Li et al., 2020）。根据组成不同，环状RNA可分为三类：由外显子组成的环状RNA（EcircRNA）、由内含子组成的环状RNA（ciRNA）以及由外显子和内含子共同组成的环状RNA（EIciRNA）（Chu et al., 2019; Kristensen et al., 2019）。越来越多的证据表明，环状RNA可作为microRNAs（miRNAs）的“海绵”，在转录后水平调节基因表达。此外，它们还可以与与疾病相关的RNA结合蛋白（RBPs）相互作用或促进其翻译。例如，circPIKfyve作为miR-21-3p的竞争性内源性RNA，增强MAVS表达并调节SCRV引发的抗病毒免疫反应（Su et al., 2021）；circRasGEF1B作为miR-21-3p的竞争性内源性RNA，增强MITA表达并影响SCRV感染后的先天抗病毒反应（Chu et al., 2021）。研究表明，circEIF3J和circPAIP2通过与转录因子结合来控制基因转录，在基因转录起始位点前300 bp处与U1 snRNP相互作用，从而以顺式方式调节母基因的线性转录本（Bolha, L. et al., 2017）。令人惊讶的是，一些环状RNA能够在核糖体的帮助下进行翻译。Yang等人发现某些环状RNA序列含有m6A修饰基序，并通过构建m6A修饰基序的突变体成功证明了m6A修饰可以驱动环状RNA的翻译（Yang et al., 2017）。综上所述，这些发现突显了环状RNA的关键免疫调节作用。

我们研究了米鱼（Miichthys miiuy）在poly（I: C）和LPS处理后的circRNA eIF4G3表达，并深入探讨了其生物学功能。定量实时PCR（qPCR）检测显示，poly（I: C）和LPS处理后circeIF4G3表达上调（Zhao et al., 2017）。结果表明，circeIF4G3参与了米鱼的抗病毒和抗菌反应，并抑制了其先天免疫反应。我们通过双荧光素酶实验验证了这一结果。circceIF4G3过表达后，细胞增殖和细胞存活率也显著下降。在研究鱼类先天免疫反应的调控过程时，环状RNA的复杂调控机制具有重要意义。环状RNA介导的免疫调控的复杂分子机制不仅揭示了鱼类如何精细调节其免疫反应，还为缓解过度炎症反应提供了宝贵的理论基础。

实验部分

样本和处理

在本实验中，米鱼（约50克）样本来自浙江省舟山渔业研究所。在免疫处理前，这些鱼在可控的循环海水系统中适应了4-5周。适应后，通过腹腔注射给予200 μl的poly（I: C）（2.5 mg/ml，InvivoGen）。对照组鱼接受了等体积（200 μl）的无菌生理盐水。每组包含三条鱼

circeIF4G3的特性

尽管环状RNA参与哺乳动物的抗病毒防御，但它们在低等脊椎动物免疫系统中的功能尚未完全阐明。通过RNA-seq数据分析poly（I: C）感染后的环状RNA表达水平，我们发现circeIF4G3表达显著升高。因此我们推测它与先天免疫有关，并在实验验证前确定了其环化特性。

讨论

环状RNA（circRNAs）作为稳定的共价闭合环结构，具有强大的调控功能，在真核生物中越来越受到重视（Zhang et al., 2012; Rodrigues et al., 2012）。虽然它们在哺乳动物免疫和癌症等疾病中的作用受到关注，但它们在硬骨鱼类，尤其是在先天免疫中的作用仍大部分未知。我们的研究通过鉴定米鱼中的新环状RNA circeIF4G3填补了这一空白。

CRediT作者贡献声明

徐天军：撰写——审稿与编辑，监督，项目管理。孙宇娜：撰写——审稿与编辑，监督，项目管理。崔艳秋：撰写——初稿，项目管理，方法学，数据管理，概念构思。陶雅琪：数据管理

未引用参考文献

Chu et al., 2020; Fitzgerald and Kagan, 2020; Kawai and Akira, 2009; Liao and Su, 2021; Takeuchi and Akira, 2010; Xu et al., 2018; Yang et al., 2017; Zhang and Gui, 2012; Zhu et al., 2023.