《Diagnostic Microbiology and Infectious Disease》：Development of a Universal Real-Time PCR TaqMan Assay for Fowl Aviadenovirus diagnosis
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禽腺病毒血清型检测：开发并验证一种针对52K基因的通用TaqMan实时荧光定量PCR方法，实现高灵敏度（5 copies/mL）、特异性（无交叉反应）和临床适用性，为禽类腺病毒感染诊断及流行病学监测提供可靠工具。
Amina Kardoudi|Siham Fellahi|Faouzi Kichou|Abdelmounaaim Allaoui|Abdelouaheb Benani
摩洛哥拉巴特哈桑二世农业与兽医研究所（Hassan II Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II）兽医病理学与公共卫生系，邮政信箱6202，10000
摘要
禽腺病毒（FAdVs）是家禽的主要病原体，与诸如包涵体肝炎（IBH）、腺病毒性肌胃糜烂（AGE）和肝心包积水综合征（HHS）等具有经济重要性的疾病相关。准确诊断对于疾病控制和监测至关重要，但现有方法受血清型多样性的限制。本研究描述了一种通用TaqMan实时PCR检测方法的开发和验证，该方法可用于检测和定量多种FAdV血清型。设计了通用引物和探针，以靶向52K基因中的一个保守区域，并优化了检测性能。分析评估显示该方法具有高效率（95%）、强线性（R2 = 0.955）以及5拷贝/毫升的检测限。该检测方法与其他禽类病原体（包括禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒）无交叉反应。精确度测试显示检测结果的内部和批次间变异性极小，变异系数低于0.02%，证实了其稳健性和重复性。在56个确诊为IBH和AGE的临床样本（涉及FAdV-1、-8a、-8b和-11血清型）以及14个健康鸡样本中进行了临床评估。该检测方法成功扩增了所有阳性样本，并与先前建立的基于SYBR Green的52K实时PCR检测方法显示出强相关性（R2 = 0.97）。总之，这种新型TaqMan实时PCR检测方法是一种快速、灵敏且高度特异的FAdV检测工具，其广泛的适用性和强大的临床性能使其适用于家禽FAdV感染的常规诊断和流行病学监测。
引言
禽腺病毒（FAdVs）是一种感染家禽和野生鸟类的DNA病毒。根据基因组分析和病毒中和（VN）测试，它们被分为五个物种（FAdV-A至FAdV-E）和12个血清型（1–7、8a、8b、9–11）[10,11]。虽然许多FAdV感染是亚临床的，但某些血清型与严重疾病相关，如包涵体肝炎（IBH）[1,2]、肌胃糜烂（GE）[6,21]和肝心包积水综合征（HHS）[23]。这些感染会导致家禽产业遭受重大经济损失，主要是由于死亡率增加和体重增长减缓[21]。FAdV感染已在多个大陆被报道，凸显了其广泛的分布和对全球家禽产业的影响[3,5,12,[14], [15], [16],23]。在摩洛哥，已报告IBH和GE病例，分别与血清型8a/11和1相关[1,17,19]，这突显了需要有效的诊断工具来检测和管理FAdV相关疫情。
FAdV感染的传统诊断方法基于病毒分离，随后进行电子显微镜分析[4,9,13,20]。然而，病毒分离耗时较长，通常需要超过两周，并且灵敏度有限，因为它依赖于新鲜样本的可用性以维持病毒活性。针对Hexon基因的传统聚合酶链反应（cPCR）检测方法已被广泛用于FAdV的检测[13]。尽管如此，基因分型需要额外的PCR后步骤，如限制性内切酶消化或核苷酸测序[5,15,18]。
另一方面，实时PCR（qPCR）检测方法因其灵敏度、快速性和定量分析能力而受到重视。开发了一种基于SYBR Green的通用实时PCR检测方法，用于通用检测FAdV血清型[8]。该检测方法表现出稳健的分析和临床性能，检测限（LOD）低于每反应10拷贝，比传统PCR灵敏度高约十倍。此外，该方法还具有成本效益和特异性，这一点通过熔解曲线分析得到了验证。最近，还开发了一种多重实时PCR方法，可以同时检测FAdV I型和III型以及禽白血病病毒。这种方法具有高灵敏度，检测限低至每反应1拷贝[22]。
本研究描述了一种通用TaqMan实时PCR（qPCR）检测方法的开发和验证，该方法能够特异性检测FAdV物种。此外，它还显示出高灵敏度和效率，适用于常规诊断应用。
参考文献和临床样本
标准FAdV菌株来自奥地利维也纳兽医大学（Vetmeduni, Vienna），以每种血清型对应的FTA卡片形式提供。使用无菌剪刀从卡片上的浸渍切片中切割片段，分别放入Eppendorf管中，并用Tris-EDTA缓冲液洗涤。本研究中使用的参考FAdV菌株及其GenBank登录号列于表1中。共收集了56个临床样本，包括肝脏和肌胃样本。
引物和探针
使用Geneious Prime 2024软件中的ClustalW算法对十二种参考FAdV菌株的完整基因组进行了比对。比对结果显示52K基因内存在一个高度保守的区域，该区域在所有十二种FAdV血清型中均存在，因此被选为引物和探针设计的靶标。最初使用Primer3算法设计了引物和探针，随后验证了它们的特异性、熔解温度和潜在的二级结构。
讨论
本研究描述了一种通用TaqMan实时PCR检测方法的开发和验证，该方法通过靶向52K基因中的一个高度保守区域来检测FAdVs。选择52K基因是基于12种参考FAdV血清型的完整基因组序列比对结果。为确保检测方法的通用性，设计了简并引物和探针以适应不同血清型之间的遗传变异。在本研究中，通过……对该检测方法进行了验证。
结论
本研究报道了一种高度灵敏、特异且可重复的通用TaqMan实时PCR检测方法的开发和验证，该方法针对52K基因的保守区域来检测禽腺病毒。该检测方法表现出优异的分析和临床性能，与参考实时PCR/52K检测方法的结果高度一致。总体而言，这是一种适用于家禽FAdV感染常规诊断和流行病学监测的稳健工具。
资助
本研究是多主题研究与发展项目的一部分，该项目得到了穆罕默德六世理工学院（UM6P）、高等教育与科学研究部（DESRS）、国家科学技术研究中心（CNRST）和Cherifien Phosphates Office基金会（FOCP）的支持，并与哈桑二世农业与兽医研究所（Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II）合作开展。
作者声明
Amina Kardoudi（A.K.）负责实验的设计、实施、数据分析及手稿撰写。
Siham Fellahi（S.F.）参与研究监督，对实验设计提供关键意见，并修订了手稿。
Faouzi Kichou（F.K.）在整个研究过程中提供总体监督和科学指导。
Abdelmounaaim Allaoui（A.A.）参与数据解释。
Abdellouhab Benani（A.B.）参与数据解释和分子分析。
[7]
Amina Kardoudi：写作 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，软件，方法学，调查，形式分析，概念化。
Siham Fellahi：写作 – 审稿与编辑，验证。
Faouzi Kichou：资源获取，资金筹集。
Abdelmounaaim Allaoui：方法学。
Abdelouaheb Benani：项目管理。
