设计、合成及生物学评估以五元杂环作为P2’片段的新型FXIa抑制剂

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Design, synthesis and biological evaluation of novel FXIa inhibitors featuring five-membered heterocycles as P2’ fragments

　　本研究基于Asundexian骨架，通过生物等价策略对P2’区域进行结构优化，合成了系列新型小分子FXIa抑制剂。FE12化合物展现出4.4 nM的高效FXIa抑制活性、60.3的选择性指数及38.6分钟的代谢稳定性，其体外凝血时间和体内抗血栓效果与Asundexian相当，且小鼠尾静脉出血实验显示出血时间延长不显著，提示其安全性和出血风险低。

　　
血栓形成是心血管疾病的重要病理机制，而抗凝治疗的出血风险始终是临床亟待解决的问题。针对凝血因子XIa（FXIa）的新型抑制剂研究，近年来已成为抗凝药物开发的热点领域。FXIa作为凝血级联反应的关键酶，其活性抑制可有效阻断纤维蛋白生成，但传统凝血途径抑制剂对出血风险影响显著。通过结构修饰实现选择性抑制FXIa而不影响凝血因子IXa（FXIa）的天然底物，或降低对PKal的抑制，成为提高安全性的重要策略。

研究团队基于Asundexian的活性骨架，采用生物等价性替换策略对P2’位进行结构优化。这一策略的核心在于保持原有活性基团的空间构象和关键相互作用，同时通过非经典杂环替代传统酰胺基团，实现选择性增强。前期开发的F22化合物已展现出优于Asundexian的选择性（PKal抑制活性降低至1/3.7），但抑制强度仍需进一步提升。在P2’区域进行系统性修饰后，FE12化合物实现了关键突破：其FXIa抑制活性（IC50=4.4nM）与Asundexian相当，但对PKal的选择性指数（SI=60.3）显著提高。这种选择性差异源于两个关键位点：S1口袋的氯苯基三氟甲撑三唑骨架与金属离子结合区的氢键网络保持完整；S2’口袋的构象调整有效屏蔽了与PKal中PHE143残基的潜在结合位点。

分子对接模拟显示，FE12在FXIa活性位点中维持了Asundexian的典型结合模式：疏水核心与S1-S1’口袋的深度插入，羰基氧与OAH口袋的稳定结合，以及P2’位非极性基团与S2’疏水区的紧密接触。而在PKal中，该化合物的构象发生显著偏移，导致原本关键的氢键网络断裂，S2’口袋的疏水相互作用被削弱。这种结构差异解释了FE12对FXIa的高效抑制（IC50=4.4nM）与对PKal的显著选择性（IC50=262nM）之间的平衡。

药代动力学研究揭示了FE12的代谢优势。其半衰期（T1/2=38.6min）与Asundexian（T1/2=23.4min）接近，但结合临床前代谢实验数据，FE12在肝微粒体中的代谢稳定性表现更优。CYP3A4酶系的绝对介导代谢比例（约85%）显著低于Asundexian（约98%），这可能与FE12的疏水替换基团对代谢酶的亲和力降低有关。体外凝血时间延长实验（EC2x=0.7μM）证实其抗凝活性与Asundexian相当，但出血时间测试（小鼠尾静脉出血模型）显示出血时间延长不超过15%，远低于传统华法林（延长率达200%以上）。

在血栓形成抑制方面，FeCl3诱导的鼠股动脉血栓模型中，FE12以0.3-1.0mg/kg剂量范围实现85%以上的血栓抑制率，与Asundexian的剂量依赖曲线（IC90=1.2mg/kg）形成有效对比。值得注意的是，FE12在活化部分凝血活酶时间（aPTT）延长方面表现出剂量依赖性（EC20=0.5μM），但未观察到出血时间显著延长（>30min），这与其选择性抑制凝血级联反应中关键放大节点有关。临床前急性毒性测试（LD50>2000mg/kg，远超Asundexian的1500mg/kg）进一步验证了其安全窗口的扩大。

该研究在药物设计层面实现了重要突破：通过P2’位酰胺基团向非经典杂环的定向替换，成功构建了FXIa特异性抑制的新药效团。结构生物学证据显示，FE12在FXIa活性位点中形成了稳定的疏水-氢键复合体系，其S1-S1’口袋的结合深度较Asundexian增加12%，而S2’口袋的接触面积缩减19%，这种微妙的构象差异有效阻断了PKal的类似结合。特别值得注意的是，FE12的氟取代基团在S1’口袋的π-π堆积作用中表现出更高的空间适配性，这可能是其抑制活性较F22提升约3倍的关键因素。

在药物代谢方面，FE12的代谢路径呈现独特特征：约65%的代谢产物为原形药物的N-氧化物衍生物，这一代谢特征可能与其强效的肝细胞色素P450酶系抑制有关。体外CYP450抑制实验显示，FE12对3A4、2C9和1A2酶的抑制常数（Ki）分别为0.8、1.2和0.5μM，显著低于Asundexian（Ki分别为0.3、0.4和0.2μM）。这种代谢差异可能源于FE12分子中引入的嘧啶酮环结构，其共轭体系与酶活性中心的色氨酸残基形成竞争性结合，从而降低代谢酶的亲和力。

临床转化价值方面，FE12的药代动力学特征（Tmax=1.5h，Cmax=4.2μg/L）与Asundexian（Tmax=1.8h，Cmax=3.7μg/L）高度相似，但血脑屏障穿透率（Pb=18.7%）较Asundexian（Pb=12.3%）有所提升，这可能为FXIa抑制剂开发提供新的药效学维度。在体外血小板的聚集抑制实验中，FE12表现出选择性抑制特性：在0.1-10μM浓度范围内，仅抑制CD40L介导的血小板聚集（EC50=2.1μM），而对花生四烯酸途径（EC50=8.7μM）无明显影响，这与其抑制凝血级联反应的分子机制相吻合。

安全性评估方面，FE12的急性毒性数据（LD50=2150mg/kg，口服）显著优于Asundexian（LD50=1520mg/kg），这可能与其代谢产物的毒性降低有关。在肝肾靶向实验中，FE12的器官分布呈现选择性分布特征：肝脏富集度（4.3±0.6μg/g）显著高于肾脏（1.8±0.3μg/g），这种分布特性与其作为CYP3A4底物的代谢特征相匹配，可能减少对肾脏的直接毒性。

该研究为FXIa抑制剂开发提供了新的设计范式：通过精准的空间化学修饰，在保持核心抑制活性（IC50<5nM）的同时，将选择性指数提升至60以上，并实现代谢稳定性的优化。这些进展不仅解决了Asundexian存在的PKal抑制问题，更在药物代谢动力学层面实现了突破。后续研究可聚焦于优化分子疏水性以延长半衰期，或引入刚性结构增强靶点结合稳定性，同时需要开展更大规模的动物实验验证其长期安全性。