原生的乳糖酶肠杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）菌株作为益生菌候选者：全面的体外和计算机模拟研究

《Food Bioscience》：Autochthonous Lacticaseibacillus rhamnosus strains as probiotic candidates: comprehensive in vitro and in silico characterization

　　研究从巴西东南部乳制品中分离25株乳酸菌，通过体外实验评估其抗微生物、抗氧化、β-半乳糖苷酶活性、胃肠耐受性、抗生素敏感性和粘附能力，结合主成分分析筛选出4株候选菌株，其中6QLR5和GTM7综合表现最佳，并通过基因组分析确认其不含抗生素耐药基因、致病因子及有害质粒，证明整合体外与基因分析有效筛选益生菌候选株。

　　

普里西拉·罗米娜·德格雷戈里奥（Priscilla Romina De Gregorio）| 伊莎多拉·利斯克（Isadora Lieske）| 凯西·尼德（Cathy Nied）| 加布里埃拉·西格诺里（Gabriela Signori）| 丹尼尔·库恩（Daniel Kuhn）| 卡罗琳·施密茨（Caroline Schmitz）| 维拉·卢西亚·米拉尼·马丁斯（Vera Lúcia Milani Martins）| 伊万·库尼亚·布斯塔曼特-菲略（Ivan Cunha Bustamante-Filho）| 约瑟·马蒂亚斯·伊拉佐基（José Matías Irazoqui）| 克劳西娅·费尔南达·沃尔肯·德索萨（Claucia Fernanda Volken de Souza）

巴西拉热阿杜（Lajeado）塔夸里河谷大学（University of Vale do Taquari - Univates）食品生物技术实验室

摘要

本研究旨在从来自巴西东南部的乳制品中分离出的25种本地乳酸菌（LAB）中筛选出具有潜力的益生菌候选菌株。通过体外实验（in vitro assays）分析了这些菌株的表型特征，重点关注其关键的益生菌属性，包括抗菌性、抗氧化性、β-半乳糖苷酶活性、对模拟胃肠道环境的耐受性、抗生素敏感性以及黏附能力。随后利用主成分分析（Principal Component Analysis）对最有前景的菌株进行了排序。在所有分离株中，四种Lactaseibacillus rhamnosus菌株（6QLR5、GTM7、CLM11和JLR3）表现出良好的抗菌活性、黏附能力、对胃肠道环境的耐受性、抗氧化能力和β-半乳糖苷酶活性。其中，6QLR5和GTM7菌株的表型特征最为突出，因此被选为进一步进行计算机模拟基因组分析的对象。功能注释揭示了与关键益生菌特性相关的基因，包括与抗氧化活性相关的氧化还原系统、黏附相关蛋白以及适应肠道恶劣环境的机制。基因组安全性评估（涵盖抗菌耐药基因、移动遗传元件、毒力因子和基因组稳定性特征）表明，6QLR5和GTM7菌株是安全的益生菌候选菌株，因为它们不携带与抗生素耐药性、致病性或毒力相关的基因，也没有有害的质粒或噬菌体。总体而言，基于综合的体外和计算机模拟方法对本地乳酸菌株的表征对于筛选益生菌候选菌株非常有效。

引言

乳酸菌（LAB）是一类功能多样、生态适应性强的微生物，能够栖息在多种环境中（Johnson & Klaenhammer, 2014; Li et al., 2024）。它们天然存在于乳制品中，也可作为发酵剂或辅助菌种添加到食品中，分别负责快速酸化牛奶或调节发酵产品的风味、香气、质地和保质期（Anumudu et al., 2024; Kuhn et al., 2025）。

微生物与培养条件

本研究使用了25种先前从牛奶和传统奶酪中分离出的乳酸菌菌株（表1）。这些菌株由库恩等人（Kuhn et al., 2025）进行过鉴定（表S1），并根据其技术特性进行分类，包括中等至强的二乙酰产生能力、对高浓度NaCl的耐受性以及无溶血活性。所有乳酸菌菌株均采用De Man、Rogosa和Sharpe（MRS）培养基（Oxoid?，英国巴斯林斯托克）进行常规培养。

乳酸菌的抗菌特性

通过琼脂覆盖法（agar overlay technique）评估了这些乳酸菌菌株对六种食源性病原体的抗菌活性。所有菌株均抑制了所有测试病原体的生长（图1和表S3）。然而，主效应分析（Main Effect Analysis）显示了显著的菌株特异性抑制作用。其中，Lactaseibacillus rhamnosus GTM7（来自牛奶）、6QLR5和3QLR2（均来自奶酪）表现出最强的抗菌活性。

体外表型分析用于筛选潜在益生菌菌株

多项研究表明，乳酸菌通过产生有机酸、过氧化氢和细菌素等抗菌物质发挥抑制作用（Hernández-Aquino et al., 2019; Sharma & Lee, 2025）。此外，潜在益生菌的抗菌活性具有菌株特异性，并且依赖于目标病原体（Campana et al., 2017; Gao et al., 2019; Karbowiak et al., 2022）。本研究对25种乳酸菌菌株的抗菌活性进行了分析。

结论

本研究旨在从25种本地来源的乳酸菌菌株中筛选出具有潜力的益生菌候选菌株。通过全面的体外表型分析并结合主成分分析，建立了一个排序系统，以筛选出具有最理想益生菌特性的菌株。其中，6QLR5和GTM7菌株因表现出多种关键益生菌特性（如抗菌活性）而脱颖而出。

CRediT作者贡献声明

克劳西娅·费尔南达·沃尔肯·德索萨（Claucia Fernanda Volken de Souza）： 负责撰写、审稿与编辑、项目监督、研究设计、资金筹集及概念构思。 普里西拉·罗米娜·德格雷戈里奥（Priscilla Romina De Gregorio）： 负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法验证、研究实施、数据分析及概念构思。 伊莎多拉·利斯克（Isadora Lieske）： 负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法验证、软件应用、研究实施及数据分析。

未引用的参考文献

巴西国家卫生监督局（Agência Nacional de Vigilancia Sanitária），2021；曹等人（Cao et al.），2019；卡尔皮等人（Carpi et al.），2022；盖法特等人（Gephart et al.），2024；国际标准化组织（International Organization for Standardization），2010；詹帕法恩等人（Jampaphaeng et al.），2017；胡亚雷斯·托马斯等人（Juárez Tomás et al.），2011；帕特里尼亚尼等人（Patrignani et al.），2016；帕特里尼亚尼等人（Patrignani et al.），2019；罗查-门多萨等人（Rocha-Mendoza et al.），2020；罗德里格斯-R等人（Rodriguez-R et al.），2024；瓦拉拉克斯米等人（Varalakshmi et al.），2013；维埃拉·达席尔瓦等人（Vieira da Silva et al.），2016；冯·奥索夫斯基等人（von Ossowski et al.），2011。

数据获取

本研究的所有补充数据均可在以下在线仓库获取： https://github.com/ilieske/DeGregorio_Lieske_et.al_2025

利益冲突

作者声明不存在可能影响本研究报告工作的已知竞争性财务利益或个人关系。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本研究报告工作的已知竞争性财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢巴西国家科学技术发展委员会（Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico，项目编号303127/2023-6、130239/2024-0）和南里奥格兰德州研究资助基金会（Funda??o de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul，项目编号10901325）提供的奖学金，以及塔夸里河谷大学（Universidade do Vale do Taquari - Univates，项目编号10901325）和FAPERGS（项目编号24/2551-0001161-7）为本研究提供的财政支持。同时，我们也感谢塞尔吉奥·E·V·G·A·科斯塔（Sérgio E. V. G. A. Costa）和马特乌斯·德拉瓦尔德（Matheus Delavald）的支持。