p-硝基苄氧羰基保护基：实现中性人乳寡糖自动化组装的关键突破

《Nature Communications》：p-nitrobenzyloxycarbonyl protective group as key to automated glycan assembly of neutral human milk oligosaccharides

　　本研究针对人乳寡糖（HMOs）化学合成中氨基保护基选择的关键难题，开发了利用p-硝基苄氧羰基（pNZ）保护葡糖胺C2-氨基的新策略。该策略显著提升了自动化糖组装（AGA）过程中糖基化偶联与去保护效率，成功合成了包括LNT、LNnT等在内的多种线性与分支HMOs，为大规模制备结构均一的HMOs提供了高效、可靠的合成路径。

　　

母乳被誉为婴儿最理想的天然食物，其中人乳寡糖（Human Milk Oligosaccharides, HMOs）是母乳中第三大固体成分，仅次于乳糖和脂肪。这些结构复杂多样的糖类分子在婴儿生长发育、免疫系统成熟以及肠道健康，特别是塑造婴儿早期肠道菌群方面扮演着至关重要的角色。然而，自然界中HMOs种类繁多（已鉴定超过200种），且结构高度分支化，从天然来源中分离获取大量、高纯度的特定HMOs结构异常困难，这极大地限制了对每种HMOs特定生物学功能的深入研究。因此，发展高效的化学合成方法，能够大量制备结构均一的HMOs，成为推动相关基础研究与潜在临床应用的关键。

传统的溶液相寡糖合成中，常用于保护葡糖胺（Glucosamine, GlcNAc）C2位氨基的基团，如三氯乙基氯甲酸酯（Troc）和邻苯二甲酰基（Phth），在应用于自动化糖组装（Automated Glycan Assembly, AGA）这一高效合成技术时，遇到了挑战。Troc对碱不稳定，而AGA流程中周期性使用碱性溶液进行清洗，导致其兼容性差。Phth虽然耐碱，但其去除通常需要苛刻的肼解条件，可能损伤敏感的糖苷键和其他临时保护基。其他尝试过的保护基，如三氯乙酰基（TCA）和苄氧羰基（Cbz），则存在糖基化反应活性低（常需预先活化为磷酸酯以提高反应性）、最终去保护时选择性差、反应条件剧烈可能导致副反应（如岩藻糖脱落）等问题。这些局限性促使研究人员寻找一种既能在AGA过程中稳定存在，又能被温和、选择性去除的氨基保护基。

为了解决这一难题，发表在《Nature Communications》上的这项研究，创新性地将肽化学中常用的p-硝基苄氧羰基（p-nitrobenzyloxycarbonyl, pNZ）保护基引入到糖化学领域。研究人员发现，pNZ保护的葡糖胺砌块在AGA中表现出卓越的性能：其适中的反应活性有助于抑制供体分解和副反应，提高合成效率；该砌块稳定性好，可直接使用硫苷供体而无需转化为更活泼的磷酸酯；并且，pNZ基团可以通过三种不同的温和方法进行选择性去除，为合成后修饰提供了极大的灵活性。

本研究主要运用了自动化糖组装（AGA）这一核心技术，通过在固相合成仪上程序化地循环进行糖基化、封端、特定保护基去除等步骤，逐步构建糖链。此外，研究涉及了糖化学中标准的保护基操作（如Fmoc、Lev的引入与去除）、以及合成产物的纯化（正相/反相高效液相色谱）与结构确证（核磁共振波谱）技术。

Preparation of N-pNZ protected building blocks

为了满足HMOs中多种天然连接方式的需求，研究人员设计并合成了四个适用于AGA的N-pNZ保护的葡糖胺砌块。这些砌块均包含永久性的苄基（Bn）醚保护基，以及两种正交的临时保护基：芴甲氧羰基（Fmoc）和乙酰丙酰基（Lev）。通过高效的合成路线，成功制备了4-O-Fmoc、4-O-Lev、3-O-Fmoc以及同时带有3-O-Lev和4-O-Fmoc的葡糖胺硫苷供体。这些砌块的合成路线简洁，中间体可通过热乙醇洗涤方便地纯化，最终经柱色谱分离得到高纯度产品。

AGA using N-pNZ protected glucosamine building blocks

以二乳糖胺四聚体（diLacNAc tetramer）为目标分子，对AGA条件进行了系统优化。关键发现包括：对于4-O-Fmoc葡糖胺供体，将其糖基化偶联温度优化至-10°C，可实现完全活化，获得27%的总产率；进一步将酸性洗涤步骤中的三甲基硅三氟甲磺酸酯（TMSOTf）浓度从1% (v/v) 降低至0.1% (v/v)，可有效抑制糖苷键的酸催化断裂，将粗品HPLC分析显示的产率提升至37%。溶剂比例和额外的碱性洗涤对糖基化效率影响较小。这些优化确立了使用pNZ保护砌块进行AGA的稳健流程。

Automated synthesis of pNZ-protected oligo-LacNAc & HMOs

在优化条件下，研究人员展示了pNZ策略在合成多种复杂HMOs结构方面的强大能力。成功合成了包含LacNAc II型（Galβ1-4GlcNAc）连接的线性寡糖（四聚体、六聚体、八聚体）。通过巧妙运用Fmoc和Lev保护基的正交性，实现了分支结构的精准构建：合成了含有Fucα1-3GlcNAc（Lewis X表位）或Fucα1-4GlcNAc（Lewis A表位）的单岩藻糖基化五糖；利用3-O-Fmoc-6-O-Lev半乳糖砌块作为分支点，高效合成了对称分支的六糖，并且与使用N-TCA或N-Cbz保护的供体相比，pNZ策略产率显著更高（29% vs 16% 和 6%）；进一步合成了结构更复杂的不对称分支十糖和含有两个岩藻糖分支的六糖；此外，还合成了表征分泌型母亲乳汁特征的α1,2-岩藻糖基化HMOs（五糖和六糖）。所有合成均在全自动糖合成仪上完成，证明了该方法的可扩展性和可靠性。

Modification of protected Oligo-LacNAc and HMOs

最后，研究人员建立了完整的全局去保护流程，将合成的保护寡糖转化为最终的目标HMOs。pNZ基团通过四羟基二硼（B₂(OH)₄）/4,4'-联吡啶的金属游离还原法高效、温和地去除，随后进行N-乙酰化。接着，通过甲醇钠处理去除所有酯保护基，最后在Pd/C催化下氢解脱除苄基等醚保护基，得到完全去保护的HMOs。通过反相HPLC纯化，一系列线性、分支、单岩藻糖基化和双岩藻糖基化的中性HMOs，如LNnT、LNT、LNFP III、LNFP II、LNnH、LNDFH II等，均以良好至优异的产率（43%至57%）获得。研究还指出，pNZ选择性去除后暴露的游离氨基，可作为进一步生物偶联或功能化修饰的把手。

本研究成功证明p-硝基苄氧羰基（pNZ）是自动化糖组装（AGA）中保护葡糖胺C2-氨基的理想选择。pNZ保护砌块制备简便、稳定性高、反应性能优良，克服了以往保护基在AGA应用中的诸多局限。利用该策略，研究人员高效、可靠地合成了包括线性、对称分支、不对称分支以及多种岩藻糖基化形式在内的15种中性人乳寡糖（HMOs）和寡乳糖胺（oligo-LacNAc）结构，产率显著优于使用TCA或Cbz保护基的对比实验。更重要的是，pNZ基团提供了三种正交的去保护路径，极大地增强了合成的灵活性和后续修饰的潜力。这项研究为大规模制备结构明确的复杂寡糖提供了强大的工具，将极大地促进对HMOs生物学功能的深入研究及其在营养、医药等领域的应用开发。