基于二维熔解曲线的多重PCR检测方法的设计，用于检测SARS-CoV-2、RSV和甲型/乙型流感病毒

《Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical Microbiology》：Design of a 2D Melting Curve–Based Multiplex PCR Assay for Detection of SARS-CoV-2/RSV/Influenza A-B

　　检测SARS-CoV-2、RSV和流感A/B的二维多聚酶链式反应（2D multiplex RT-qPCR）方法设计及验证，采用分子信标技术和熔解温度（Tm）分析实现单孔同步检测，显示72°C（SARS-CoV-2）、66°C（RSV）、56°C/68°C（流感A/B）和80.5°C（内控）特征Tm，无交叉反应。

　　
近年来，呼吸道病原体的快速检测技术成为公共卫生领域的研究热点。随着全球呼吸道传染病季节性流行趋势加剧，多病原联合检测技术因其高效、精准的特点备受关注。2025年初欧洲地区流感、RSV和新冠病毒的阳性率分别达到49%、6%和2%，纽约市同期报告的流感与RSV感染病例超过1.8万例，这凸显了开发高效检测方案的迫切性。传统PCR检测多采用单靶标设计，不仅需要复杂的多重反应体系，还存在交叉污染风险。相比之下，基于熔解曲线分析的多重RT-qPCR技术展现出显著优势，通过特异性探针设计实现单通道多靶标检测，其核心原理在于不同核酸序列的熔解温度（Tm值）差异。

在实验设计方面，研究者选用550份来自Kocaeli大学临床样本进行验证。样本覆盖了新冠病毒、呼吸道合胞病毒及流感病毒A/B型，其中阳性样本占比达65%。为优化检测性能，团队创新性地引入分子信标技术，通过设计含磷酸解修饰的探针与特异性引物组合，在单反应体系内实现多重靶标检测。该方法的关键突破在于构建了具有严格Tm梯度设计的探针体系：流感病毒A/B型探针采用FAM标记，Tm值分别为56℃和68℃；RSV探针使用FAM标记，Tm值为66℃；新冠病毒探针为FAM标记，Tm值72℃。内参对照采用HEX标记的RNase P基因，其Tm值设定为80.5℃，形成完整的温度分隔体系（间隔6℃以上）。

实验验证显示，该体系在标准检测中展现出优异的特异性。通过熔解曲线分析，各靶标在温度扫描区间内形成特征性峰形，与文献报道的Tm值高度吻合（新冠病毒72℃、RSV66℃、流感A56℃、流感B68℃）。值得注意的是，内参对照的设置显著提升了检测可靠性，其80.5℃的Tm值完全避开了其他靶标检测范围，确保实验有效性。通过对比商业检测套盒，新方法在检测通量（单次可检24个靶标）、试剂成本（降低约70%）和时间效率（缩短至1.5小时）方面具有显著优势。

技术优势体现在三个层面：首先，单通道检测系统简化了实验流程，将传统需要8孔板的检测浓缩至1孔完成，减少了样本污染风险；其次，内置的实时内参对照（RNase P基因）有效规避了RNA降解和试剂污染导致的假阴性结果；最后，独特的探针设计使温度分辨率达到±0.1℃，成功实现了SARS-CoV-2与流感B（差4℃）、RSV与流感A（差10℃）等近缘靶标的准确区分。

在方法学创新方面，研究者开发了双模块探针设计策略。外层探针包含发夹结构用于稳定核酸复合物，内层探针则设计有PspGI限制性内切酶识别位点。这种嵌套式结构确保了在PCR扩增后（72℃延伸阶段）能够特异性切割目标产物，释放荧光标记的Taq酶片段，形成独特的熔解曲线特征。探针长度经过精密计算，新冠病毒探针为30bp，RSV为24bp，流感探针为16bp，这种梯度设计有效避免了探针间的非特异性杂交。

临床应用验证部分显示，该方法在混合感染检测中表现优异。例如，同时感染流感A和新冠病毒的样本（n=7）能够清晰区分出两个独立峰（56℃和72℃），与单独感染样本的检测结果完全一致。对于呼吸道合胞病毒与副流感病毒的交叉检测，通过设置内参对照（80.5℃）和引入额外探针（如HEX标记的M蛋白基因），成功实现了检测灵敏度的提升，达到23.08 copies/反应的检测下限。

讨论部分揭示了该技术的扩展潜力。研究者指出，当前体系已具备向更多病原体扩展的基础设施，包括但不限于：HPV分型检测（6型、11型、16型、18型等）、性传播疾病检测（沙眼衣原体、淋病奈瑟菌等）、胃肠道病原体检测（沙门氏菌、弯曲杆菌等）以及脑膜炎病原体检测（细菌、真菌、病毒等）。这种模块化设计使得后续开发其他临床检测模块仅需更换探针和引物组合，无需重构实验体系。

局限性分析部分指出，现有方案尚未完全解决分型检测（如流感A/B区分）和变异株识别（如新冠病毒奥密克戎变种）的问题。但通过引入探针交换机制，仅需更换探针即可实现检测靶标的动态调整。此外，内参对照的实时监测功能可辅助诊断样本的污染情况，当内参信号缺失时系统自动触发警报。

该研究的重要启示在于：基于熔解曲线的多重RT-qPCR技术不仅适用于呼吸道传染病检测，更为其他临床检测提供可借鉴的解决方案。例如在HPV分型检测中，通过设计不同Tm值的探针组合，可在单次实验中完成高危型与低危型病毒的鉴别。在性传播疾病检测中，采用多通道荧光标记技术可同时检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体等6种病原体。这种技术范式革新将推动临床检测从"单一靶标验证"向"多组学联合诊断"转变，对于降低基层医疗机构的检测成本（按当前设计，单次检测成本可从商业套盒的15美元降至3.2美元）具有重要现实意义。

未来研究方向建议从三个维度展开：首先优化探针设计，将Tm值梯度从6℃压缩至4℃，以增加检测通量；其次开发自动化处理系统，集成样本预处理、PCR反应和熔解曲线分析的全流程；最后开展大规模临床验证，特别是混合感染样本（如新冠病毒与流感的双重感染）的检测准确性评估。这些改进将进一步提升该技术的临床适用性和推广价值，为全球呼吸道疾病防控提供关键技术支撑。