超越基质屏障：基于3D模型重新思考囊性纤维化生物被膜中抗生素耐受性的新机制

《npj Biofilms and Microbiomes》：Beyond the matrix: rethinking antibiotic tolerance in CF biofilms using 3D models

　　本研究针对囊性纤维化(CF)患者慢性肺部感染中铜绿假单胞菌(PA)生物被膜抗生素耐受机制不明确的问题，开发了基于乙酰化藻酸盐和DNA的3D生物被膜模型。研究发现藻酸盐乙酰化虽不影响抗生素扩散，但显著增强细菌耐受性，而DNA的添加可逆转此效应。该成果挑战了传统"扩散限制"理论，为开发新型抗生物被膜疗法提供了新思路。

　　

在囊性纤维化(CF)患者的肺部，一场无声的战争持续上演。黏稠的 mucus（黏液）为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)提供了理想的庇护所，使这种细菌能够形成坚固的生物被膜(biofilm)，导致慢性感染反复发作。更令人困扰的是，这些生物被膜对抗生素表现出惊人的耐受性，使得常规治疗往往以失败告终。传统观点认为，生物被膜中的胞外聚合物基质如同坚固的"堡垒"，通过物理阻挡抗生素的渗透来保护细菌。但这一理论是否完全解释了生物被膜的耐药机制？基质中的关键成分究竟如何影响抗生素效果？这些问题一直困扰着研究人员。

为揭开这一谜团，来自奥地利自然资源与生命科学大学(BOKU)和维也纳工业大学(TU Wien)的研究团队在《npj Biofilms and Microbiomes》上发表了一项创新研究。他们不再满足于传统的二维培养模型，而是利用先进的3D打印技术，构建了能够精确模拟CF肺部感染环境的生物被膜模型，深入探究了藻酸盐(alginate)乙酰化(acetylation)和胞外DNA(eDNA)在抗生素耐受性中的真实作用。

研究人员采用了多项关键技术：通过化学方法对海藻来源的藻酸盐进行选择性乙酰化，使其乙酰化程度达到36%，以模拟天然黏液型PA产生的藻酸盐；利用3D生物打印技术制备藻酸盐基生物墨水(bioink)，构建包含PAO1菌株的盘状和珠状生物被膜模型；通过抑制圈扩散实验评估抗生素在各类模型中的渗透能力；结合共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和冷冻扫描电镜(CryoSEM)分析细菌微菌落的结构和分布；采用微量肉汤稀释法测定最小抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)，并进一步评估最小生物被膜抑制浓度(MBIC)和最小生物被膜根除浓度(MBEC)。

PA生长和分布在生物被膜模型中的情况

研究发现，PAO1在藻酸盐模型中24小时内即可形成均匀分布的微菌落(microcolony)，大小约为7-15微米，每个菌落包含185±1.3至476±8.1个细胞。细菌在24小时内增殖约四个数量级，从初始的～25×10⁹CFU ml^-1增至～15×10¹³CFU ml^-1，表明模型成功支持了活跃的细菌生长和微菌落形成。

藻酸盐乙酰化对抗生素在生物被膜模型中扩散的影响

令人惊讶的是，藻酸盐乙酰化对大多数抗生素的扩散影响甚微。妥布霉素(tobramycin, TOB)、庆大霉素(gentamicin, GEN)、环丙沙星(ciprofloxacin, CIP)、多黏菌素(colistin, COL)、美罗培南(meropenem, MER)和氨曲南(aztreonam, AZT)在乙酰化和非乙酰化藻酸盐模型中的扩散速率无显著差异(p≥0.05)。所有抗生素在20小时内均能达到扩散平衡，表明乙酰化本身并不构成主要的抗生素扩散屏障。

DNA在乙酰化藻酸盐模型中对抗生素扩散的影响

添加DNA对抗生素扩散的影响具有药物特异性和时间依赖性。DNA显著降低了庆大霉素在8和20小时的扩散(p≤0.05)，以及环丙沙星在8小时(p≤0.05)和多黏菌素在4小时的扩散(p≤0.05)。然而，DNA对妥布霉素的扩散无显著影响，且使美罗培南在4小时的扩散增加(p≤0.05)。这些结果表明，静电相互作用并非决定DNA对抗生素扩散影响的唯一因素。

抗生素在黏液型生物被膜中的扩散：与体外生物被膜模型的比较分析

与简化模型形成鲜明对比的是，天然黏液型生物被膜显著阻碍了抗生素扩散。多黏菌素和庆大霉素在20小时内完全无法渗透，妥布霉素在4和8小时几乎不扩散，直至20小时才达到平衡。环丙沙星、氨曲南和美罗培南的扩散也显著延迟。这表明天然生物被膜的复杂组分或结构创造了额外的扩散屏障，而不仅仅是藻酸盐和eDNA的作用。

乙酰化和DNA在调节抗生素敏感性中的作用

藻酸盐包被极大增强了PAO1的抗生素耐受性。乙酰化进一步增强了细菌对妥布霉素、环丙沙星和多黏菌素的耐受性，但对美罗培南、氨曲南和多黏菌素的效果相反。添加DNA至乙酰化藻酸盐模型降低了耐受性，使PAO1对庆大霉素、环丙沙星、多黏菌素和美罗培南更敏感(p≤0.05)。

包被PAO1的浓度依赖性抗生素杀灭

浓度依赖性杀灭实验显示，包被的PAO1对美罗培南和氨曲南表现出显著耐受性，即使在高浓度下(>1024μg ml^-1)也难以完全根除。藻酸盐乙酰化使妥布霉素、环丙沙星和多黏菌素达到≥99.9%杀菌效果所需浓度提高4倍以上，而添加DNA可逆转此效应，将所需浓度降低3倍以上。

铜绿假单胞菌在生物被膜模型中抗生素敏感性的变化

最小生物被膜抑制浓度(MBIC)和最小生物被膜根除浓度(MBEC)值远高于对应抗生素的MIC值。在乙酰化藻酸盐模型中，多黏菌素和氨曲南的MBIC值高达MIC的1000倍，而氨曲南和美罗培南的MBEC值超过MIC的1024倍。添加DNA降低了妥布霉素、环丙沙星和多黏菌素的MBEC值，但对庆大霉素、氨曲南和美罗培南无显著影响。

研究结论挑战了生物被膜抗生素耐受性主要源于基质扩散屏障的传统观点。研究表明，即使抗生素能充分渗透至生物被膜内部，包埋在藻酸盐基质中的细菌仍能存活，表明耐受性主要源于封装触发的细菌适应性反应，而非单纯的物理阻挡。藻酸盐乙酰化虽不影响抗生素扩散，但能显著增强耐受性，这可能与其改变基质机械性能、诱导细菌应激响应有关。而DNA的添加反而在一定程度上削弱了藻酸盐的保护作用。

这项研究的意义在于将抗生物被膜策略的焦点从"突破基质屏障"转向"干扰细菌适应性响应"。研究开发的3D生物被膜模型为高通量筛选新型抗生物被膜药物提供了可靠平台，为治疗CF患者慢性肺部感染开辟了新途径。未来研究将进一步探索封装触发的具体分子机制，以及如何通过联合疗法克服生物被膜相关的抗生素耐受性。