《Vaccine》：Generation of a shelf-stable, broadly-reactive influenza vaccine formulated with TLR4, TLR7/8, or TLR9 stimulating adjuvants
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薄层冷冻干燥技术制备的COBRA流感疫苗与TLR4/7/8激动剂联用可增强交叉保护效果，所有组别均有效抵御H1N1挑战。
罗伯特·A·理查森（Robert A. Richardson）| 月亮彩荷（Chaeho Moon）| 切罗基·M·桑兹（Cherrokee M. Sands）| 罗恩·纳尔逊（Ron Nelson）| 戴尔·J·克里斯滕森（Dale J. Christensen）| 格雷戈里·J·达文波特（Gregory J. Davenport）| 唐纳德·E·欧文斯（Donald E. Owens）| 特德·M·罗斯（Ted M. Ross）
佛罗里达研究与创新中心，克利夫兰诊所，美国佛罗里达州波特圣卢西（Florida Research and Innovation Center, Cleveland Clinic, Port Saint Lucie, FL, USA）
摘要
疫苗向世界欠发达地区的分配常常受到缺乏高效冷链网络的阻碍。在这项研究中，采用了薄膜冷冻（TFF）技术对下一代流感疫苗进行冻干处理，以实现长期储存。基于计算优化的广谱反应性抗原（COBRA）方法制备的流感H1和H3血凝素蛋白与三种趋化因子受体（TLR）激动剂之一混合：CpG1826（TLR9激动剂）、INI-2002（TLR4激动剂）或INI-4001（TLR7/8激动剂）。冻干后，这些疫苗用磷酸盐缓冲盐水（PBS）复溶，并通过鼻腔途径接种给雪貂。含有TLR4或TLR7/8佐剂的疫苗对H1N1和H3N2流感病毒的免疫活性比使用TLR9佐剂的COBRA HA疫苗更广。然而，无论使用哪种佐剂，所有接种疫苗的雪貂都能有效抵抗H1N1流感病毒的攻击。总体而言，通过薄膜冷冻技术制备的疫苗在鼻腔给药后能够有效引发保护性免疫反应。
引言
流感病毒（Orthomyxoviridae科）是全球公共卫生的主要威胁，会导致季节性流行病，偶尔还会引发大流行[1]。每个季节，流感病毒感染导致全球29万至64万人死亡，其中撒哈拉以南非洲、西太平洋和东南亚地区的死亡率最高[2]。这些病毒会发生抗原漂移和变异，从而逃避宿主针对病毒表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的免疫反应[1][3][4][5][6][7][8]。虽然目前的商业疫苗可以降低每个季节的发病率和死亡率，但仍需要设计下一代疫苗策略来抵御变异的流感病毒[1,8]。下一代流感疫苗的目标是激发持久的细胞和体液免疫反应，以中和多种流感病毒株[8]。
下一代流感疫苗的主要候选方案之一是计算衍生的广谱反应性抗原（COBRA）。该策略利用分层共识序列构建方法设计血凝素蛋白，以引发针对多种流感病毒株的保护性抗体[7]。Y2 COBRA重组血凝素（sHA）使用2014年5月至2016年9月间分离的H1N1血凝素序列开发，NG2 COBRA sHA则使用2016年5月至2018年8月间分离的H3N2血凝素序列开发[6,7]。这些疫苗已在小鼠和雪貂身上进行了肌肉注射和鼻腔给药测试，与其他COBRA血凝素和神经氨酸酶抗原以及多种佐剂联合使用[3][4][5][6][7][9][10]。
在这项研究中，基于蛋白质的疫苗与三种不同的TLR激动剂结合使用。TLR是先天免疫受体，能够识别多种病原体相关分子模式（PAMP），广泛存在于体内的先天免疫细胞中[11]。合成的氧化腺嘌呤TLR7/8激动剂INI-4001和TLR4激动剂INI-2004可作为肌肉注射和鼻腔给药的佐剂，有效刺激Th1偏向性的抗原特异性保护性免疫反应[12,13]。此外，未甲基化的CpG寡脱氧核苷酸（ODN）1826（CpG-1826）也是TLR9激动剂，可作为蛋白质疫苗配方的有效佐剂[14,15]。这三种TLR激动剂通过激活树突状细胞和其他抗原呈递细胞来增强适应性免疫反应，促进重组蛋白的吸收和抗原呈递[11]。鼻腔给药时，基于蛋白质的疫苗能引发高水平的IgA体液反应，并增加呼吸道中的组织驻留记忆淋巴细胞数量[9,10,15,16]。
Y2和NG2 sHA疫苗分别使用了CpG-1826、INI-4001或INI-2004佐剂，并通过薄膜冷冻（TFF）技术冻干，得到室温（21°C）下稳定的粉末[17]（图1）。这种TFF技术由TFF Pharmaceuticals公司首创，此前已用于其他蛋白质疫苗和抗病毒疗法的冻干[18][19][20]。这些干粉疫苗无需冷链基础设施即可运输和储存。每种TFF疫苗/佐剂干粉均需复溶成水相后通过鼻腔给药给雪貂，以评估其抗体反应和对抗流感病毒的效果。
部分内容摘要
佐剂配方
CpG-1826购自InvivoGen（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。INI-2004和INI-4001脂质体配方的成分包括1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）、胆固醇（Chol）和3β-[N-(N′,N′-二甲氨基乙烷)氨基甲酰]胆固醇（DCC），均由Avanti Polar Lipids Inc.（美国阿拉巴马州伯明翰）提供。磷酸钠和柠檬酸钠缓冲液成分购自ThermoFisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。所有试剂均为分析级。
干粉配制的COBRA HA疫苗对多种H1N1和H3N2流感病毒具有免疫活性
实验前雪貂在0天和28天接种疫苗，每次接种后2周采集血清样本进行血清学检测。所有雪貂均感染了SG/86和PN/99流感病毒，感染后4周再次采集血清样本。所有雪貂在感染后第28天均产生血清转化（见补充图1）。随后，这些雪貂接种了含有三种佐剂之一的Y2/NG2 COBRA HA疫苗。所有统计结果……
讨论
通过鼻腔给药的重组亚单位蛋白疫苗由于抗原呈递细胞的摄取和呈递能力较低，引发的免疫反应有限[27]。大多数鼻腔给药的亚单位疫苗通常会搭配佐剂以增强疫苗成分的吸收。在本研究中，三种不同的TLR激动剂与下一代COBRA HA蛋白结合使用，用于接种雪貂。CpG-1826是一种TLR9激动剂，可模拟未甲基化的CpG……
CRediT作者贡献声明
罗伯特·A·理查森（Robert A. Richardson）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、调查、数据分析、数据管理。月亮彩荷（Chaeho Moon）：数据分析、方法学研究、审稿与编辑。切罗基·M·桑兹（Cherrokee M. Sands）：方法学研究。罗恩·纳尔逊（Ron Nelson）：数据管理。戴尔·J·克里斯滕森（Dale J. Christensen）：方法学研究。格雷戈里·J·达文波特（Gregory J. Davenport）：资金获取、资源协调、审稿与编辑。唐纳德·E·欧文斯（Donald E. Owens）：撰写 – 审稿与编辑、方法学研究。特德·M·罗斯（Ted M. Ross）：撰写 – 审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
我们感谢Spencer Pierce、James Allen、Matthew Thomas、Amanda Lynch和Jessica Medina提供的技术支持。感谢Kondareddy Cherukula和Austin Negorn对手稿的审阅和修改。部分H1N1和H3N2病毒样本来自世界卫生组织流感监测、流行病学和控制合作中心（美国乔治亚州亚特兰大）的流感试剂资源部门。同时感谢克利夫兰诊所的……
