连接酶介导的可编程基因组整合（L-PGI）：一种无需外源写入酶的高精度基因编辑新方法

《Nature Communications》：Ligase-mediated programmable genomic integration (L-PGI)

　　本研究针对传统CRISPR/Cas9系统产生双链断裂导致异质性编辑结果、以及逆转录酶依赖型编辑在长片段插入和非分裂细胞中效率低下的问题，开发了连接酶介导的可编程基因组整合（L-PGI）技术。该技术通过Cas9切口酶产生基因组切口，利用DNA连接酶将预合成的DNA供体直接整合到基因组中，在细胞系、原代细胞和成年小鼠中实现了高达82.4%的编辑效率和62.7%的保真度，为基因治疗提供了新策略。

　　

基因编辑领域近年来取得突破性进展，特别是CRISPR/Cas9系统的发现彻底改变了基因组工程领域。然而，传统CRISPR/Cas9系统通过产生DNA双链断裂（DSBs）来实现基因编辑，这种方法虽然有效，但常常导致不必要的副作用，如异质性编辑结果包含插入或缺失（indels）、潜在的脱靶效应、染色体重排甚至染色体丢失等问题，限制了其在许多遗传疾病治疗中的应用。

为克服这些限制，研究人员开发了更精细的基因编辑工具，如单链切口酶（nCas9）或完全催化失活的Cas9（dCas9）。特别是将nCas9与逆转录酶（RT）结合使用的Prime Editing（PE）技术，能够从RNA模板进行基因编辑而不产生双链断裂。然而，这种基于转录的编辑方法存在明显局限性：长片段编辑（>10个核苷酸）效率低，在原代细胞中表现不佳，这很可能与细胞内脱氧核苷三磷酸（dNTP）池有限有关。

为了解决这些问题，Tome Biosciences公司和Replace Therapeutics公司的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项创新性研究，提出了一种全新的基因编辑方法——连接酶介导的可编程基因组整合（Ligase-mediated programmable genomic integration，L-PGI）。这种方法不依赖外源写入酶，而是利用DNA连接酶直接将预合成的DNA供体整合到基因组中。

研究人员主要通过以下几种关键技术方法开展研究：首先，他们设计了包含三个杂交结构域的桥接DNA（splint），用于连接供体DNA、引导RNA和基因组靶位点；其次，优化了包括锁定核酸（LNA）在内的寡核苷酸化学修饰，提高系统稳定性和效率；第三，开发了配对L-PGI（pL-PGI）系统，通过同时在两条链上引入编辑来提高长片段插入效率；第四，使用脂质纳米颗粒（LNP）进行体内递送；最后，通过下一代测序（NGS）和微滴式数字PCR（ddPCR）等多种方法全面评估编辑效率和保真度。研究使用了HEK293T细胞系、原代人肝细胞（PHH）、原代小鼠肝细胞（PMH）和原代食蟹猴肝细胞（PCH）等多种细胞模型，并在成年小鼠中进行了体内验证。

L-PGI机制与优化

研究人员首先阐述了L-PGI的工作原理：利用nCas9在基因组非靶链上产生切口，暴露出3'羟基末端，DNA连接酶识别这一末端，在含有5'磷酸的合成DNA供体存在下直接修饰基因组。他们通过包含供体结合位点（DBS）、基因组瓣结合位点（FBS）和引导结合位点（GBS）的互补DNA桥接分子，将供体、基因组和引导RNA的3'末端连接起来，实现所有编辑组分的共定位。

经过系统优化，研究团队确定了最佳参数：DBS长度22-26核苷酸，FBS长度11-13核苷酸，GBS长度19-20核苷酸。在酶选择方面，T4连接酶表现最优。化学修饰方面，在DBS和GBS的3'末端交替引入锁定核酸（LNA）显著提高了效率。使用N1-甲基假尿苷（N1-methylpseudoinosine）制备的mRNA使编辑效率提高了近2倍。

L-PGI在治疗靶点中的应用

在治疗相关基因编辑方面，L-PGI表现出显著优势。在威尔逊病相关基因ATP7B的H1069Q突变和血色素沉着症相关基因HFE的C282Y突变编辑中，L-PGI在原代人肝细胞（PHH）中的编辑效率达到19.9%，保真度97.9%，显著优于PrimeEditing系统。

研究人员还探索了通过编辑基因启动子区域调节基因表达的治疗策略。以心血管疾病治疗靶点APOA1为例，L-PGI实现了高达66.0%的编辑效率，而PE-TB3仅为48.0%。此外，L-PGI在14个碱基对的转录因子结合位点插入编辑中表现出34.9%的总编辑效率和更高的保真度。

配对L-PGI系统

为克服长片段编辑效率下降的问题，研究团队开发了配对L-PGI（pL-PGI）系统，通过同时在两条链上引入编辑，显著提高了长片段插入效率。pL-PGI在造血干细胞（HSCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）中分别实现了21.2%和16.9%的Bxb1整合酶识别位点（attB）插入效率。在VEGFA基因座的175个碱基对删除编辑中，pL-PGI在HEK293T细胞、iPSCs和PHH中的效率分别是逆转录酶编辑器的3倍、1.6倍和16倍。

pL-PGI用于整合酶介导的基因组插入

研究团队进一步优化pL-PGI用于Bxb1整合酶介导的大片段基因插入。他们发现10个碱基对的重叠区域在编辑效率和保真度方面表现最优。通过优化供体化学修饰（去除所有甲基化同时保留两个硫代磷酸酯键），他们在苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因内含子1中成功插入38个碱基对的attB位点，并与Bxb1整合酶和辅助依赖性腺病毒（HDAd）载体协同使用，实现了14.4%的全基因插入效率和59.6%的attB转换率。

pL-PGI的跨物种转化

研究显示pL-PGI在不同物种的原代肝细胞中均表现出高效编辑能力。在原代小鼠肝细胞（PMH）中，pL-PGI实现了10.0%的功能性attB插入，而双PE-TB2几乎无法实现正确插入。此外，pL-PGI在食蟹猴肝细胞（PCH）和人类肝细胞（PHH）中也表现出与双PE-TB2相当或更优的编辑效率。

L-PGI和pL-PGI的体内应用

在成年小鼠体内实验中，pL-PGI在attB位点插入中的平均效率为7.9%，而双PE-TB3仅为2.5%，显示出3倍优势。在14个碱基对插入编辑中，L-PGI的平均效率为3.8%，也显著高于PE-TB3的1.9%。尽管观察到暂时性肝毒性指标（ALT和AST）升高，但这些效应是短暂的，且未导致动物不良反应。

研究结论与意义

这项研究开发的L-PGI和pL-PGI技术代表了基因编辑领域的重要进展。与基于逆转录酶的编辑系统相比，L-PGI在中等长度编辑（约14个碱基对）方面具有显著更高的效率和保真度，这类编辑对于通过安装转录因子结合位点实现内源性基因增强等应用至关重要。同时，pL-PGI能够实现更长的插入片段，为外显子替换等更复杂的基因治疗策略奠定了基础。

研究还证明，通过一系列优化，L-PGI和pL-PGI能够通过写入整合酶着陆位点实现数千个碱基对的大片段基因插入，且比基于逆转录酶的编辑更准确，从而显著提高了Bxb1整合效率。此外，研究展示了将8个独立RNA和DNA组分配制在单个脂质纳米颗粒（LNP）中的可行性，以及L-PGI和pL-PGI在成年小鼠中的高效编辑能力。

尽管在注射后观察到肝毒性指标暂时升高，但这些效应是短暂的，可能通过进一步的试剂优化和组分工程来减轻。研究人员指出，虽然本研究未探索脱靶编辑，但由于其对切口（而非双链断裂）的依赖性，预计L-PGI的脱靶风险极低，但这需要后续实验验证。

总体而言，L-PGI作为一种有效且多功能的基因编辑系统，在体内肝脏治疗方面具有关键优势，特别是在逆转录酶编辑具有挑战性的物种（如小鼠）中表现出更强的普适性效率。通过解决基于逆转录酶编辑的基本缺陷，L-PGI可能在下一代基因编辑疗法中发挥重要作用。未来的研究方向包括脱靶分析、毒性降低、编辑能力扩展以及新型治疗策略的进一步应用。