RED-CRISPR：基于λ噬菌体重组酶Redα/β增强的高效精准转基因敲入技术

《Nature Communications》：Efficient high-precision transgene knock-in by Recombinases (Redα/β)-enhanced DNA integration-CRISPR-Cas9 (RED-CRISPR)

　　本文报道了一种名为RED-CRISPR的新型基因编辑工具，通过将λ噬菌体来源的Redα/β重组酶与CRISPR-Cas9系统融合，显著提高了大片段DNA（>1 kb）同源定向修复（HDR）效率（提升2-5倍），同时显著降低了脱靶效应和染色体易位风险。该技术在CAR-T细胞制备、疾病iPS细胞基因校正和转基因小鼠模型构建中展现出卓越应用价值，为精准基因治疗提供了新策略。

　　

基因编辑技术CRISPR-Cas9的出现彻底改变了生命科学领域的研究范式，然而精准高效地将大片段DNA整合到基因组特定位置仍是当前技术瓶颈。尤其在进行基因治疗、疾病模型构建和细胞治疗时，传统的同源定向修复（HDR）效率低下，且易产生插入缺失（indel）等副产物，严重制约了其临床应用潜力。

在这一背景下，中国科学技术大学鲍建强团队及其合作者开发了一种名为RED-CRISPR的新型基因编辑平台。该技术巧妙地将λ噬菌体来源的Redα/β重组酶系统与CRISPR-Cas9相结合，显著提升了基因敲入的精准度和效率。这项突破性研究成果已发表在《Nature Communications》上，为基因治疗和生物医学研究提供了强大工具。

研究团队采用蛋白质工程策略，将Redα（5'-3'核酸外切酶）和Redβ（单链退火蛋白）与Cas9核酸酶进行融合表达。通过系统优化 linker序列和核定位信号，构建了多种融合变体，其中Cas9-Redα-Redβ三融合体表现最优。研究利用荧光报告系统、流式细胞术、高通量测序（包括GUIDE-seq和PEM-seq）等技术，在HEK293T、HeLa、HCT116等细胞系，以及原代T细胞、人诱导多能干细胞（iPSC）和小鼠胚胎中全面评估了RED-CRISPR的性能。

Cas9-Redα-Redβ融合提升基因尺寸DNA敲入效率

研究人员首先在HEK293T细胞中使用BFP-to-GFP报告系统验证RED-CRISPR的基础性能。结果显示，与标准Cas9相比，Cas9-Redα-Redβ融合蛋白将HDR效率提高了1.8-2倍。在内源性GAPDH和HSP90AA1位点进行1.4 kb IRES-mCherry片段敲入实验时，RED-CRISPR在HEK293T细胞中分别实现了2.8倍和2倍的提升，在HeLa细胞中提升达4倍和2倍。

RED-CRISPR改善HDR:indel比率并增强多等位基因编辑

通过amplicon-seq深度测序分析发现，RED-CRISPR不仅提高了精确HDR效率，还显著降低了indel副产物。在单细胞克隆水平，RED-CRISPR将纯合敲入克隆比例从6.7%提升至18.8%（2.8倍），显著改善了多等位基因编辑效率。

RED-CRISPR实现大片段DNA安装并与其他HDR增强因子协同

研究证明RED-CRISPR可高效敲入2.5 kb双顺反子荧光表达盒，效率达20%。当与细胞周期调节剂nocodazole或CTS（Cas9靶向序列）供体组合使用时，产生了协同效应，在GAPDH位点HDR效率提升达5.3倍。此外，RED-CRISPR与Cas9切口酶（nickase）联用也显著改善了编辑效率。

RED-CRISPR降低脱靶风险

通过优化的GUIDE-seq技术检测发现，RED-CRISPR在MYC1位点将脱靶位点数量从平均38个减少至14个，脱靶:靶向比率降低约70%。在EMX1、HSP90AA1和GAPDH位点也观察到类似趋势。

RED-CRISPR减轻全局染色体易位事件

PEM-seq分析显示，RED-CRISPR在EMX1位点将染色体易位频率从1.45%降至0.89%（HEK293T细胞）和从1.53%降至0.67%（HeLa细胞），显著降低了结构性重排风险。

RED-CRISPR提升人原代T细胞和疾病相关iPS细胞中的转基因敲入

在原代T细胞中，RED-CRISPR在AAVS1、HSP90AA1和ACTB位点的敲入效率提升2-4倍。在镰状细胞病患者来源的iPS细胞中，成功校正了HBB基因突变（Glu→Val），效率显著提高，且保持了细胞多能性。

RED-CRISPR系统高效生成CAR-T细胞

使用RED-CRISPR制备CD19-CAR-T细胞时，质粒转染效率从4.69%提升至11.73%，mRNA转染效率从27.7%进一步提升至44.3%。体外杀伤实验表明，RED-CRISPR生成的CAR-T细胞具有更强抗肿瘤活性。

RED-CRISPR在大型片段转基因小鼠模型构建中表现优异

在小鼠胚胎中，RED-CRISPR将8 kb大片段DNA的敲入效率从2.44%大幅提升至43.28%，成功构建了H11和CaMKII位点的转基因小鼠模型，且后代生长发育正常。

研究结论表明，RED-CRISPR通过Redα介导的DNA末端切除和Redβ促进的链退火机制，协同增强了HDR效率。这一技术平台兼容多种递送方式（质粒、mRNA、RNP），适用于不同细胞类型和应用场景，为基因治疗、疾病建模和基础研究提供了强大工具。特别值得一提的是，RED-CRISPR在提升效率的同时显著降低了脱靶效应和染色体不稳定性，为其临床转化提供了安全保障。未来通过进一步优化蛋白质结构和递送策略，RED-CRISPR有望在精准医学领域发挥更大价值。