利用CRISPR/Cas9核糖核蛋白抑制HBV的复制和表达

《Antiviral Research》：Suppression of HBV replication and expression by CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins

　　CRISPR/Cas9技术通过合成gRNA/Cas9 RNP非病毒递送系统抑制HBV感染，研究显示gRNA5和gRNA9及其组合可显著降低HBV DNA/RNA及蛋白表达，DNA测序证实高突变率，且靶序列在主要HBV毒株中高度保守，为新型基因治疗策略提供潜力。

　　

Addison C. Hill|Madison B. Schank|Yi Zhang|Ning Sun|Ling Wang|Juan Zhao|Puja Banik|Jaeden S. Pyburn|Holly Orfield|Janet W. Lightner|Tabitha O. Leshaodo|Xiao Y. Wu|Shunbin Ning|Mohamed Elgazzar|Jonathan P. Moorman|Haitao Guo|Zhi Q. Yao

东田纳西州立大学James H. Quillen医学院炎症、传染病与免疫卓越中心，约翰逊城，田纳西州37614

摘要

HBV感染是一个全球性的公共卫生问题。目前使用核苷酸类似物（NA）的治疗方法可以抑制病毒复制，但由于共价闭合环状DNA（cccDNA）的持续存在，无法根除HBV感染。cccDNA维持着HBV的复制并整合到宿主细胞基因组中，且对NA治疗具有抗性。CRISPR/Cas9技术已被用于破坏整合的HBV DNA和迷你染色体cccDNA以抑制HBV，但其表达和递送需要病毒或非病毒载体，这给人类应用带来了安全风险。我们之前报道了使用合成引导RNA（gRNA）/Cas9核糖核蛋白（RNP）作为非病毒制剂进行HBV基因编辑和病毒抑制的方法。为了开发高效的CRISPR/Cas9疗法用于HBV基因治疗，我们设计了额外的gRNA/Cas9 RNP，并比较了它们在HBV转染细胞和HBV感染细胞中的抗病毒效果。研究发现，两种选定的gRNA/Cas9 RNP（gRNA5/Cas9、gRNA9/Cas9及其组合）表现出最强的抗病毒效果，这通过显著抑制HBV DNA、RNA和蛋白质的产生得到了证实。处理过的细胞DNA测序显示，在HBV目标基因处出现了中等至高频率的插入和删除（indel）或敲除（KO）突变。基因比对分析表明，gRNA5和gRNA9的目标序列在主要HBV基因型中具有高度保守性，表明这些基于CRISPR的基因编辑疗法具有针对全球不同HBV菌株的潜力。因此，这些合成gRNA/Cas9 RNP代表了有前景的新疗法，可以用于破坏HBV基因并根除病毒。

引言

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性的公共卫生问题，超过2.5亿人患有慢性乙型肝炎（CHB），该疾病可能进展为终末期肝病，包括肝硬化和肝细胞癌（HCC）1,2。目前使用核苷酸类似物（NA）的抗病毒治疗可以抑制HBV复制，但由于HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）的持续存在而无法根除HBV感染3,4。cccDNA维持病毒复制并整合到宿主细胞基因组中，且对NA治疗具有抗性5,6。因此，开发新的遗传方法来破坏感染细胞中的HBV整合DNA和迷你染色体cccDNA是实现HBV根除的未满足医疗需求7,8。

CRISPR/Cas9技术是一种有吸引力的靶向基因编辑方法9,10，因此被用于对抗HBV感染11,12。先前的研究表明，CRISPR/Cas9介导的基因编辑可以破坏HBV DNA和cccDNA，从而抑制病毒复制13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24。然而，当前的CRISPR/Cas9表达和递送系统通常需要病毒或非病毒载体，这给人类应用带来了安全风险25,26。因此，合成引导RNA（gRNA）/Cas9核糖核蛋白（RNP）是一种具有多种优势的非病毒制剂，包括快速DNA切割、较低的脱靶效应、低风险插入突变、易于合成和多重化以及适合临床使用27,28。

我们之前报道了使用合成gRNA/Cas9 RNP来抑制HBV和HIV复制29,30。为了开发更有效的CRISPR/Cas9疗法用于HBV基因治疗，我们设计了额外的gRNA/Cas9 RNP，并比较了它们在HBV转染的HepG2.2.15细胞以及HBV感染的原代人肝细胞（PHHs）中的抗病毒效果。通过qPCR和ELISA方法，并通过Western blotting、Southern blotting和DNA测序验证，我们证明两种选定的gRNA/Cas9 RNP（gRNA5/Cas9、gRNA9/Cas9及其组合在重复处理中表现出出色的抗病毒效果，有可能作为治疗HBV感染的新疗法。

小节片段

设计针对HBV基因组的gRNA

识别针对HBV复制关键基因的gRNA是设计基于CRISPR/Cas9疗法的第一步。我们之前设计了9种gRNA（gRNA1-9），这些gRNA针对HBV基因组中高度保守的区域，包括聚合酶（P）基因、衣壳（C）基因、表面（S）基因和X基因，并确定gRNA5（针对HBV S/P基因）和gRNA9（针对HBV X/P基因）在HBV细胞中具有最特异和最强的抗病毒活性

讨论

尽管CRISPR/Cas9技术多年来已被用于体外和体内实验模型中破坏HBV基因表达，但由于抗病毒效果有限、药物递送效果不佳以及安全问题，这一方法尚未在临床应用于HBV治疗。在本研究中，我们比较了针对HBV基因组不同位点的选定gRNA/Cas9 RNP的抗病毒效果。我们证明gRNA5/Cas9和gRNA9/Cas9（特别是它们的组合）

细胞培养和HBV感染

HepG2.2.15人肝细胞系（Cat# SCC249，Millipore Sigma，马萨诸塞州伯灵顿）在含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素（Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆）和400 μg/mL G418硫酸盐（Cat#: 61-234-RG，康宁，马萨诸塞州特克斯伯里）的DMEM/F-12培养基中培养，培养条件为37°C和5% CO₂环境。HepDE19细胞在含有1 μg/ml Tet和400 μg/mL G418的培养基中，在胶原蛋白包被的平板上维持

CRediT作者贡献声明

Puja Banik：撰写 – 审稿与编辑。Jonathan P. Moorman：撰写 – 审稿与编辑、项目管理、监督。Ning Sun：撰写 – 审稿与编辑、研究、数据管理。Mohamed Elgazzar：撰写 – 审稿与编辑。Yi Zhang：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、方法学、研究、数据分析。Zhi Q. Yao：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、监督、项目管理、资金获取

利益冲突声明

共同作者Haitao Guo博士担任《Antiviral Research》杂志的编辑：鉴于其编辑职务，Haitao Guo博士未参与本文的同行评审，也无法获取有关同行评审的信息。本文的编辑工作完全由另一位期刊编辑负责。所有其他作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果

利益冲突声明

? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：共同作者Haitao Guo博士担任《Antiviral Research》杂志的编辑：鉴于其编辑职务，Haitao Guo博士未参与本文的同行评审，也无法获取有关同行评审的信息。本文的编辑工作完全由另一位期刊编辑负责。如果有其他作者，他们

致谢与披露：

本项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）的资助（R21AI157909、R01AI177624）和VA-TTP BRAVE奖（授予Z.Q.Y）的支持。我们感谢Biopredic International（法国圣格雷瓜尔）和中央医学与生命科学研究所（CIEM，日本川崎）提供用于本研究的HepaSH?肝细胞。我们感谢Biopredic International提供所有必要的培养基和补充物。本出版物是