基于剪接体调控的SpC编辑器：实现精准CRISPR基因编辑与增强抗肿瘤疗效的新策略

《Nucleic Acids Research》：An SpC editor targeting pre-mRNA splicing for precise CRISPR control and enhanced antitumor efficacy

　　本刊推荐：为应对CRISPR/Cas9系统存在的脱靶效应等安全性问题，研究人员开发了一种剪接体响应型CRISPR/Cas9（SpC）编辑器。该系统通过剪接抑制剂Pladienolide B（PB）调控pre-mRNA剪接过程，从而控制抗CRISPR蛋白AcrIIA4的表达，实现对Cas9核酸酶活性的精准调控。研究通过体内外生物发光成像验证了该系统的可靠性，并设计双靶点sgRNA靶向白喉毒素A基因（DTA），成功诱导多种肿瘤细胞凋亡。该研究为癌症基因治疗提供了新型可控工具。

　　

在基因治疗飞速发展的今天，CRISPR/Cas9（成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9）系统以其高效、可编程的特性成为精准医疗领域的明星工具。然而，这把"基因剪刀"在临床应用过程中始终面临着脱靶效应的安全隐患——就像一位技艺高超但偶尔会剪错位置的裁缝，可能对非目标DNA序列造成意外切割。如何给这把"分子剪刀"加上安全开关，实现精准可控的基因编辑，成为领域内亟待突破的瓶颈。

与此同时，科学家将目光投向了基因表达过程中的关键环节——pre-mRNA（前信使核糖核酸）剪接。这个被称为剪接体（spliceosome）的精密分子机器，负责将基因转录产物中的内含子切除、外显子连接，形成成熟mRNA。在《Nucleic Acids Research》发表的最新研究中，西安交通大学与西安电子科技大学联合团队另辟蹊径，将剪接体调控机制与CRISPR系统巧妙结合，开发出一种新型的剪接体响应型CRISPR/Cas9（SpC）编辑器。

该研究的创新之处在于利用小分子药物Pladienolide B（PB）作为"调控开关"。PB是一种已知的剪接体抑制剂，能够通过靶向剪接体相关蛋白130（SAP130），以剂量依赖方式抑制剪接体因子3B亚基（SF3B1），从而干扰pre-mRNA与U2小核核糖核蛋白（U2 snRNP）的相互作用。研究人员将抗CRISPR蛋白AcrIIA4基因嵌入人磷酸甘油酸异构酶（TPI）基因的内含子区域，构建成Sp-Acr载体。当不存在PB时，剪接过程正常进行，AcrIIA4随内含子被切除，Cas9蛋白保持活性状态；而当加入PB后，剪接过程被抑制，内含子得以保留，AcrIIA4蛋白表达并抑制Cas9活性，从而实现对基因编辑过程的精准调控。

为验证这一设计，研究团队首先以萤火虫荧光素酶（Fluc）为报告基因构建了SpC-F系统。通过优化sgRNA（单向导RNA）设计、质粒比例等参数，发现当sgRNA与Cas9质粒比例为1:1时，系统在10 nM PB诱导下可产生3.9倍的荧光信号增强。特别值得注意的是，该系统对PB表现出高度特异性，其他剪接抑制剂如isoginkgetin和nusinersen均未能引发类似反应。RT-PCR（逆转录-聚合酶链反应）结果直接证实，PB处理确实导致了剪接成熟产物的减少，从分子水平验证了调控机制。

更令人振奋的是，活体成像实验结果显示，在小鼠皮下植入经SpC-F系统处理的HEK293T细胞后，PB处理组相比对照组产生了6.2倍的生物发光信号增强，证明该系统在活体水平同样有效。

在技术方法方面，研究主要通过分子克隆构建剪接调控载体，利用细胞转染和药物处理实现条件性基因编辑，采用生物发光成像和RT-PCR进行功能验证，并通过细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭实验评估抗肿瘤效果。

构建和优化用于基因治疗的SpC-D编辑器

在概念验证成功后，团队进一步开发了用于肿瘤基因治疗的SpC-D系统。该系统将下游靶基因替换为具有强效细胞毒性的白喉毒素A链基因（DTA）。DTA通过催化ADP（腺苷二磷酸）核糖基化并失活延伸因子2（eEF2），能够极低浓度下抑制蛋白质合成并诱导细胞凋亡。为提高编辑精确度，研究人员还设计了同时靶向DTA基因两个位点的双靶点sgRNA_DTA。

优化实验发现，当sgRNA与Cas9质粒比例为1:2时，SpC-D系统在A549和HepG2等肿瘤细胞中展现出最强的生长抑制效果，细胞活力下降达2.7-5.7倍。值得注意的是，pDTA质粒浓度需要精细调控，浓度过高（800-1000 ng）会导致背景毒性效应，表明系统调控需要保持适当的表达平衡。

SpC-D系统调控肿瘤细胞行为

功能实验结果表明，SpC-D系统能显著影响肿瘤细胞的恶性表型。伤口愈合实验显示，在A549和HepG2细胞中，SpC-D+PB处理组的细胞迁移速率较对照组降低约35%-40%。Transwell（ transmembrane cell migration and invasion assay，跨膜细胞迁移和侵袭实验）分析进一步证实，该系统能有效抑制肿瘤细胞的侵袭能力。

流式细胞术分析揭示，SpC-D+PB处理能诱导高达60%的肿瘤细胞凋亡。细胞周期检测发现，处理组S期细胞显著减少，G₀/G₁期细胞增加，表明DTA表达引起了细胞周期阻滞和凋亡双重效应。

这项研究成功构建了一种新型的剪接体响应型基因编辑平台，通过小分子药物PB实现对CRISPR/Cas9系统的精准调控。该系统的独特优势在于将基因编辑控制权交给了剪接体这一天然分子机器，既利用了CRISPR系统的高效性，又通过内源调控机制大大提高了安全性。双靶点sgRNA设计进一步降低了脱靶风险，而DTA基因的应用则赋予了系统强大的肿瘤杀伤能力。

值得注意的是，该技术平台具有广泛的应用前景。不仅限于肿瘤治疗，这种可控性基因编辑策略还可应用于遗传病治疗、再生医学等领域，为精准医疗提供了新的技术工具。当然，该技术向临床转化仍面临挑战，包括递送效率、长期安全性等问题需要进一步研究。但毫无疑问，这项工作是基因编辑可控化方向的重要突破，为下一代基因治疗技术的发展开辟了新路径。

研究最终表明，SpC编辑器不仅为癌症基因治疗提供了新思路，更重要的是建立了一种普适性的基因调控策略，通过整合内源剪接机制与外源基因编辑工具，实现了对生命过程更为精细的干预与控制。这种"师法自然"的研究思路，或许正是未来生物技术发展的重要方向。