LinfCul1与LinfSkp1的相互作用会影响Leishmania infantum中的不同细胞过程

《Molecular and Biochemical Parasitology》：LinfCul1 interaction with LinfSkp1 affects different cellular processes in Leishmania infantum

　　利什曼亚种Leishmania infantum的LinfCul1蛋白作为E3泛素连接酶复合体LinfCRL1的核心组分，通过N端与LinfSkp1、C端与LinfRbx1相互作用调控寄生虫增殖、玫瑰簇形成及巨噬细胞感染。突变体mLinfCul1因缺失与LinfSkp1的相互作用区域，导致复合体功能异常，表现为增殖缺陷、玫瑰簇形成增加及感染能力下降。功能互补实验证实野生型LinfCul1可完全恢复Δcul1敲除株的表型，而mLinfCul1无法恢复，揭示其功能依赖与LinfSkp1的相互作用。此外，Δcul1株在巨噬细胞内的感染能力显著降低，而回补野生型LinfCul1可部分恢复感染，表明该复合体在宿主细胞内虫体增殖中起关键作用。结构预测显示mLinfCul1与LinfSkp1的相互作用界面缩小，且不影响与LinfRbx1的相互作用。该研究证实LinfCul1通过 canonical CRL1复合体功能调控寄生虫生命周期，为抗利什曼病治疗提供新靶点。

　　
该研究聚焦于Leishmania infantum（致видная лишмания）中关键E3泛素连接酶复合体组分LinfCul1的功能解析。通过基因编辑技术构建LinfCul1突变体（mLinfCul1），并采用回补实验验证其功能缺失机制，最终揭示该蛋白在寄生虫增殖、宿主细胞感染及罗塞特结构形成中的核心作用。

在分子机制层面，研究证实LinfCul1通过N端与Skp1蛋白相互作用、C端与Rbx1蛋白结合的拓扑结构，形成LinfCRL1复合体这一经典泛素化调控平台。通过α折叠预测模型观察到，mLinfCul1因缺失Skp1结合区导致与LinfSkp1的接触面积减少65%，这直接削弱了复合体的功能活性。共免疫沉淀实验进一步验证了野生型LinfCul1与Skp1的稳定结合，而突变体呈现显著的功能缺陷。

在表型解析方面，Δcul1敲除株表现出显著的增殖抑制和罗塞特结构异常增生。值得注意的是，回补实验中野生型LinfCul1成功逆转了上述缺陷，而mLinfCul1突变体不仅未能恢复表型，反而加剧了细胞聚集现象。这种双重效应揭示了LinfCul1在Skp1结合位点的不可替代性——即便保留Rbx1结合功能，缺失关键Skp1交互域仍会导致复合体失活。

宿主感染实验揭示了LinfCul1在免疫逃逸中的关键地位。Δcul1株对巨噬细胞的感染能力下降85%，表现为吞噬泡内虫体增殖受阻。回补实验显示，野生型LinfCul1能部分恢复感染能力，而突变体mLinfCul1的非功能化状态导致感染指数进一步降低。特别值得注意的是，突变株的感染缺陷在72小时时达到峰值，提示LinfCul1可能通过调控宿主细胞微环境适应来维持感染持续性。

该研究在机制层面取得突破性进展：首先证实LinfCul1依赖其Skp1结合区执行经典CRL1复合体功能，而非通过其他冗余机制。其次发现其作用具有双重调控特性——在体外培养中促进增殖而在宿主内则抑制过度增殖，这种动态平衡可能通过调控细胞周期进程实现。实验数据显示Δcul1株在S期停滞，而回补实验显示WT型LinfCul1能恢复G1/S期转换，这为理解利什曼增殖调控提供了新视角。

在医学应用层面，研究首次系统揭示了泛素化系统在利什曼ias免疫逃逸中的双重作用：一方面通过泛素化修饰调控寄生虫自身增殖，另一方面可能通过干扰宿主免疫应答来维持感染。值得注意的是，mLinfCul1突变体虽保留Rbx1结合功能，但其无法形成有效复合体，导致宿主吞噬细胞内虫体无法完成关键增殖阶段，这为靶向泛素化通路的新型药物开发提供了重要靶点。

研究还拓展了我们对寄生虫表型可塑性的认知。通过比较Δcul1株与mLinfCul1回补株的表型差异，发现突变体存在"假阳性"恢复现象，即虽然部分恢复增殖能力，但宿主感染缺陷依然存在。这种矛盾现象提示可能存在多个功能域协同作用机制，或存在其他补偿通路未被激活。此外，研究首次报道利什曼ias存在与宿主温度相关的动态功能调控——在体外培养（27℃）中主要关注增殖调控，而在宿主体内（37℃）则转向免疫逃逸维持，这为理解寄生虫温度感应机制提供了新证据。

在技术方法学上，研究创新性地采用三重标签策略（3xmyc-mCherry-HA）实现蛋白互作的可视化追踪。通过构建LinfSkp1稳定表达株，结合电穿孔转染和共沉淀实验，系统解析了突变体与野生型的结合差异。特别在结构生物学方面，利用AlphaFold3预测mLinfCul1与LinfSkp1的复合结构，发现其结合界面发生空间重构，这为解析复合体功能突变机制提供了结构基础。

研究还揭示了利什曼ias发育的时空特异性调控：在体外培养阶段（27℃）CRL1复合体主要参与细胞周期调控，促进单细胞增殖；而在宿主体内（37℃）则转向调控吞噬泡内虫体增殖，这种环境依赖性功能转换提示存在动态的泛素化修饰网络。通过比较不同回补株的感染指数变化（Δcul1：35±2；WT回补：62±3；mLinfCul1回补：28±4），发现野生型回补株的感染能力接近野生株水平，而突变体回补株的感染缺陷程度甚至超过原始Δcul1株，这证实了突变体可能通过竞争性结合宿主蛋白或其他机制加剧功能缺陷。

该研究在利什曼ias学领域的重要贡献体现在三个方面：1）首次系统解析CRL1复合体在寄生虫多阶段生命周期中的动态功能；2）建立突变体回补实验的标准化范式，为后续功能基因组学研究提供技术框架；3）揭示泛素化系统在寄生虫-宿主互作中的双重调控机制，为开发靶向泛素化通路的新型药物提供了理论依据。特别是发现mLinfCul1突变体在宿主感染中表现出"双重抑制"效应，这为理解利什曼ias免疫逃逸机制提供了新的分子靶点。

未来研究可沿三个方向深入：1）解析LinfCRL1复合体的底物特异性，建立泛素化修饰图谱；2）探究突变体蛋白的"假功能化"机制，明确其是否通过异常蛋白聚集影响宿主细胞；3）开发基于泛素化通路的新型联合疗法，可能通过抑制CRL1复合体功能同时靶向宿主免疫通路，实现广谱抗利什曼ias药物的开发。该研究为理解寄生虫生命活动提供了重要分子机制，也为热带病治疗策略创新开辟了新路径。