胶质母细胞瘤个性化时间疗法：整合昼夜节律分析与PK-PD模型优化替莫唑胺给药时机

《npj Precision Oncology》：Personalized chronotherapy in glioblastoma: integrating circadian profiling and PK–PD modelling to optimize temozolomide timing

　　本研究针对胶质母细胞瘤（GBM）传统替莫唑胺（TMZ）化疗疗效有限且时间疗法效果不一致的难题，通过整合昼夜节律分析与药代动力学-药效学（PK-PD）建模，开发了个性化TMZ时间治疗新策略。研究发现TMZ疗效具有昼夜时间依赖性，并受核心时钟基因（如BMAL1、PER2、NR1D1）调控；建立的机制性数学模型能准确预测不同昼夜表型下的最佳给药时间。该研究为基于患者个体昼夜节律特征优化GBM治疗提供了重要理论依据和实践框架。

　　

胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）是成人中最常见且最具侵袭性的原发性脑肿瘤，尽管经过多年研究，患者预后仍然极差，标准治疗方案自2005年确立以来未有突破。替莫唑胺（Temozolomide, TMZ）是GBM化疗的基石药物，但其疗效有限，且肿瘤容易产生耐药性。近年来，时间疗法（Chronotherapy）——即根据人体生物钟节律安排给药时间——在癌症治疗中展现出潜力。研究表明，TMZ的疗效可能具有昼夜时间依赖性，与核心生物钟基因BMAL1的表达峰值以及DNA修复酶MGMT的活性谷值相关。然而，临床研究结果并不一致，部分原因可能在于缺乏对患者个体昼夜节律特征的考虑。因此，开发个性化的时间治疗策略，对于提高GBM治疗效果至关重要。

为了深入探索个性化TMZ时间疗法的可行性，Nina Nelson、Oliver Zimmer和Angela Relogio团队在《npj Precision Oncology》上发表了他们的最新研究。他们旨在阐明昼夜节律调控TMZ疗效的分子机制，并开发一个能够预测个体化最佳治疗时间的计算模型。

研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：利用三种具有不同遗传背景和昼夜节律表型的人GBM细胞系（U87-MG, T98G, U251-MG）作为体外模型；通过生物发光报告基因（BMAL1::LUC, PER2::LUC）实时监测细胞昼夜节律活动；采用qRT-PCR技术定量分析核心时钟基因（BMAL1, PER2, NR1D1, NR1D2, CRY1, CRY2）的节律性表达；利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建核心时钟基因（BMAL1, PER2, NR1D1）敲除的细胞系；通过实时细胞分析系统（IncuCyte）评估不同时间点给药的TMZ和时钟调节剂（KL001, SR9011）的疗效；并建立了一个创新的机制性药代动力学-药效学（Pharmacokinetic-Pharmacodynamic, PK-PD）模型，该模型将TMZ的细胞作用机制与核心时钟网络（Core Clock Network, CCN）相耦合，用于模拟和预测治疗反应。

昼夜节律分析揭示GBM细胞系存在不同的节律特征

研究人员首先表征了三种GBM细胞系的昼夜节律表型。所有细胞系在BMAL1和PER2启动子水平均表现出稳健的昼夜节律振荡，但它们在周期、振幅和相位上存在显著差异。例如，T98G细胞显示出最稳健的24小时节律，而U87-MG周期延长（26.9小时），U251-MG周期缩短（19.9小时）。在mRNA水平，T98G的所有六个核心时钟基因均呈现显著节律性，而U87-MG和U251-MG在某些基因上节律性减弱或消失。这些发现表明GBM细胞间存在显著的昼夜节律异质性，这可能是其时间治疗反应差异的基础。

TMZ和时钟调节剂的时间治疗效应因昼夜节律表型和给药时间而异

接下来，研究团队在BMAL1表达的不同阶段（波谷、上升期、峰值、下降期）对细胞进行TMZ、CRY激动剂KL001和REV-ERB激动剂SR9011的处理。结果表明，绝大多数治疗方案的疗效都存在显著的昼夜时间依赖性。然而，最佳给药时间和最有效的药物组合因细胞系而异。例如，在T98G细胞中，TMZ与SR9011或KL001+SR9011的联合治疗效果优于TMZ单药。而在U87-MG细胞中，SR9011单药疗效显著，且与TMZ联合在特定时间点效果最佳。U251-MG细胞则对KL001表现出独特的敏感性。这些结果强有力地证明，TMZ和时钟靶向药物的疗效受到昼夜节律时钟的调节，且这种调节具有时间和细胞系特异性。

TMZ治疗反应与昼夜节律时钟存在机制性关联

通过相关性分析，研究人员发现KL001的疗效与负向节律环路组件（如NR1D1, PER2, CRY2）的表达呈负相关，提示这些基因可能调节KL001的敏感性。此外，治疗本身也会扰动细胞的昼夜节律。在T98G细胞中，治疗效应与PER2启动子节律的振幅呈负相关，即疗效越好，PER2节律被破坏得越严重，这表明治疗引起的节律改变可能作为疗效的预测指标。

核心时钟基因的遗传学破坏改变药物敏感性和昼夜节律动力学

为了直接验证时钟功能的重要性，研究者在节律最稳健的T98G细胞中敲除了BMAL1、PER2和NR1D1基因。结果显示，时钟基因的破坏普遍导致细胞对TMZ产生耐药性，尤其是NR1D1和PER2敲除细胞。相反，这些敲除细胞对时钟调节剂KL001和SR9011的敏感性则显著增强。例如，在野生型细胞中对SR9011无反应的T98G细胞，在BMAL1和PER2敲除后却变得高度敏感。遗传学扰动还改变了治疗反应的时间依赖性，特别是在PER2敲除细胞中，大多数治疗失去了时间依赖性，表明PER2在介导时间治疗反应中扮演关键角色。

机制性PK-PD模型重现TMZ疗效的昼夜节律变异并预测最佳治疗时间点

研究的关键进展是构建了一个整合核心时钟网络的机制性PK-PD模型。该模型成功模拟了野生型T98G细胞中TMZ疗效的昼夜波动，并准确预测了PER2和NR1D1敲除细胞中的治疗反应变化。模型预测BMAL1完全敲除将导致节律和疗效时间依赖性的完全丧失，但实验数据仍显示出残余节律性，提示可能存在BMAL1非依赖的补偿机制。模型还提供了机制性解释：例如，PER2敲除导致CRY上调和MGMT表达增加，从而增强DNA修复和TMZ耐药；而NR1D1敲除则通过降低BMAL1表达来减弱对MGMT的抑制，同样导致耐药。该模型为将来基于个体时钟基因表达谱预测最佳给药时间提供了强大的计算工具。

本研究通过实验与计算模型相结合，证实了昼夜节律时钟是调节GBM对TMZ反应的关键因素。研究发现TMZ疗效具有显著的昼夜和时间依赖性，并受到核心时钟基因和药理调节剂的深刻影响。遗传学扰动时钟会改变药物敏感性并削弱治疗的时间依赖性。所开发的机制性数学模型不仅能高度还原实验观察结果，还揭示了潜在的分子通路，为未来临床实现个性化TMZ时间疗法奠定了坚实的基础。尽管研究存在局限性（如仅使用细胞系模型、未直接评估MGMT节律等），但它无疑为推动基于昼夜节律生物学的精准肿瘤治疗策略迈出了重要一步。未来的研究方向包括在更复杂的模型（如肿瘤球体、共培养体系）中验证这些发现，并最终将这种整合了昼夜节律分析和数学建模的个性化策略转化为针对GBM患者的临床实践。