利用Cre重组酶介导的标记物回收技术，对硅藻Phaeodactylum tricornutum进行迭代路径工程改造，以增强其长链多不饱和脂肪酸的生物合成能力

《New Phytologist》：Iterative pathway engineering of the diatom Phaeodactylum tricornutum to enhance the biosynthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids using the Cre recombinase-mediated marker recycling

　　硅藻Phaeodactylum tricornutum遗传操作标记有限，本研究开发P1噬菌体来源的Cre/loxP重组系统，实现标记移除与回收，结合多基因组装技术提升EPA生物合成效率，野生型EPA含量25%，转基因株达31%，最大光自养培养产量3 mg/l/d。

　　

摘要

• 在硅藻Phaeodactylum tricornutum中，可用于遗传操作的标记基因非常有限，这限制了该藻类在生物技术中的代谢工程应用。在这里，我们开发了一种源自噬菌体P1的Cre/loxP重组系统，能够在P. tricornutum中实现选择性标记基因的切除和回收。
• 赋予Zeocin抗性的Sh ble基因盒两侧带有相同方向的loxP位点，可以通过硝酸还原酶基因的启动子控制下的Cre重组酶表达来切除该基因盒；或者通过细菌接合将这个基因盒编码在表观基因组复制载体上。为了防止在Escherichia coli中发生自我切除，我们在Cre重组酶的开放阅读框（ORF）中插入了一个内含子。
• 将这种Cre/loxP系统与多基因组装技术结合，可以对P. tricornutum进行迭代性的途径工程改造，以增强二十碳五烯酸（EPA）的生物合成能力。野生型藻类中EPA在总脂肪酸中的平均含量为25%，而在经过六次转基因改造的藻株中这一比例提高到了31%。进一步的光自养培养实验表明，这些转基因藻株的最大EPA产量可达3 mg l^?1 d^?1。
• Cre/loxP系统将成为一种高效工具，用于获得无标记的转基因藻株，并可应用于具有复杂代谢途径的硅藻的基因工程，以生产有价值的代谢产物。

数据可用性

支持本研究结果的数据可在论文及其辅助信息文件中找到。这些数据包括单基因过表达（OE）、首次转化、第二次转化、光照条件以及不同培养基下的脂肪酸分析结果（数据集S1）。用于增强LC-PUFAs生物合成的物种及相关蛋白质序列的NCBI/GenBank登录号如下：Mortierella alpina（MaC16E，GenBank: KAF9965880）、Phaeodactylum tricornutum（PtD0-1，GenBank: EEC43716.1；PtD0-2，GenBank: EEC43799.1；PtDes9，GenBank: EEC47008.1；PtDes12，GenBank: ACI65609.1；PtDes6，GenBank: EEC45637.1；PtDes15，GenBank: EEC42985.1；PtELO6B_1，GenBank: EEC45843.1；PtELO6B_2，GenBank: EEC47836.1；PtDes5A，GenBank: ACI65202.1；PtDes5B，GenBank: EEC45594.1）。