缺氧激活的HSP90AA1/STUB1轴通过稳定坏死凋亡相关蛋白促进急性胰腺炎的发生

《Life Sciences》：Hypoxia-activated HSP90AA1/STUB1 axis promotes acute pancreatitis via necroptosis protein stabilization

　　本研究通过生物信息学分析、共免疫沉淀及泛素化实验，结合体外和体内AP模型，揭示HSP90AA1/STUB1轴在缺氧微环境下通过稳定RIPK1、RIPK3和MLKL促进AP坏死性凋亡的关键机制，为靶向治疗提供新思路。

　　

宋天娇|朱晨曦宇|罗金权|陈黄|陈立勋|陈洪毅|柯俊|林世荣|陈峰

福州大学附属省级医院，中国福州，350001

摘要

急性胰腺炎（AP）是一种常见的炎症性疾病，在重症病例中死亡率较高。尽管坏死性凋亡引发的炎症级联反应对预后有显著影响，但有效的治疗手段仍然有限。本研究通过生物信息学分析、共免疫沉淀和泛素化实验，以及体外和体内的酪蛋白诱导的急性胰腺炎模型，探讨了坏死性凋亡在急性胰腺炎进展中的作用。我们发现，急性胰腺炎特有的缺氧微环境通过HIF-1α介导的转录上调激活了HSP90AA1/STUB1轴。HSP90AA1/STUB1轴通过防止RIPK1、RIPK3和MLKL的泛素化降解，稳定了这些坏死性凋亡执行因子，从而促进了由坏死性凋亡驱动的急性胰腺炎进展。这项工作确立了缺氧微环境-HIF-1α-HSP90AA1/STUB1-坏死性凋亡轴作为急性胰腺炎发病机制的核心途径，为针对坏死性凋亡引起的炎症提供了新的治疗机会。

引言

急性胰腺炎的全球发病率持续上升，主要归因于肥胖、糖尿病和人口老龄化的增加[1,2]。这使急性胰腺炎成为全球最常见的需要住院治疗的胃肠道疾病之一[3,4]。急性胰腺炎的主要临床问题在于其可能发展为威胁生命的重症急性胰腺炎（SAP），其死亡率超过20%[5,6]。因此，阻止急性胰腺炎向重症急性胰腺炎的进展仍然是研究人员面临的关键挑战。目前的共识认为，在急性胰腺炎早期阶段抑制炎症介质的过度释放是最可行的治疗策略[7]。然而，对相关分子机制的不完全理解仍然阻碍了临床转化，迫切需要阐明这些机制以推动治疗发展。

在胰腺炎早期阶段，程序性细胞死亡是大量炎症介质释放的主要驱动因素[8]。作为一种新的细胞死亡方式，坏死性凋亡在急性胰腺炎进展中的作用受到了广泛关注[9]。越来越多的证据表明，坏死性凋亡会引发大量的细胞因子和趋化因子释放，加速炎症进程，并导致比传统凋亡更严重的组织损伤[10]。因此，这可能为控制急性胰腺炎的炎症和改善预后提供潜在的治疗策略。He等人的研究表明，RIPK3介导了急性胰腺炎中的腺泡细胞坏死性凋亡，抑制RIPK3可以显著减少胰腺坏死[11]。Louhim等人进一步证实，即使在胰腺炎症已经发生后，针对坏死性凋亡途径的干预仍然有效，这突显了坏死性凋亡靶向干预的治疗窗口。因此，探索针对坏死性凋亡的干预措施对于延缓急性胰腺炎的进展具有巨大潜力。

坏死性凋亡依赖于RIPK1、RIPK3和MLKL的依次激活。先前的研究表明，单独抑制任何一种蛋白质都无法完全抑制坏死性凋亡。因此，本研究旨在探索是否存在能够同时调节这三种蛋白质的基因。通过整合公共数据库分析和实验结果，本研究确定了HSP90AA1作为一个具有潜在调节作用的基因。HSP90AA1是一种高度保守的分子伴侣蛋白，在真核细胞中广泛表达[12]。它通过与共伴侣蛋白和数百种靶蛋白相互作用，在各种组织和器官中执行多种功能[13]。Hu等人[14]发现HSP90AA1通过NF-κB信号通路发挥作用，从而引发炎症[15]。鉴于急性胰腺炎是一种炎症性疾病，HSP90AA1在该疾病中的作用尚不明确。本研究旨在探讨HSP90AA1在急性胰腺炎中的作用，并阐明其具体机制。

急性胰腺炎特有的缺氧微环境是另一个关键的病理特征。由于炎症期间微血管功能障碍和氧气消耗增加，胰腺缺氧会激活缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）及其下游信号通路。这种缺氧应激可能是坏死性凋亡调控的上游触发因素，尽管将缺氧与急性胰腺炎中的坏死性凋亡联系起来的具体分子机制尚未明确[16]。

然而，同时控制多种坏死性凋亡蛋白的上游调节因子尚不清楚，将胰腺缺氧与坏死性凋亡激活联系起来的分子机制也尚未完全阐明。本研究旨在确定急性胰腺炎中坏死性凋亡的关键上游调节因子，并阐明它们与缺氧微环境的关系，最终为急性胰腺炎的治疗提供新的靶点。

实验部分

急性胰腺炎大鼠模型的建立

从中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所获得了Sprague-Dawley大鼠（225–250克）。通过每隔1小时腹腔注射一次酪蛋白（50微克/千克），并在最后一次注射后立即注射脂多糖（LPS，10毫克/千克）来诱导急性胰腺炎。大鼠在第一次注射后24小时被安乐死。

体外急性胰腺炎模型的建立

通过用酪蛋白诱导AR42J和HPDE 6-C7细胞系来建立体外急性胰腺炎模型。细胞在Ham's F12培养基中培养

急性胰腺炎的特点是广泛的坏死性凋亡

在本研究中，我们在AR42J和HPDE6-C7细胞以及大鼠中建立了急性胰腺炎模型。24小时后，从动物模型中取出胰腺组织，进行苏木精和伊红（H&E）染色并评估损伤程度。与对照组相比，急性胰腺炎组观察到明显的炎症增加（图1A和B）。急性胰腺炎模型的血清淀粉酶和脂肪酶水平显著升高（图1C–D）。此外，ELISA分析显示...

讨论

急性胰腺炎是全球最常见的、最具挑战性的胃肠道疾病之一，尤其是在发达国家，其发病率持续上升，由于长期住院、慢性并发症以及可能发展为威胁生命的重症急性胰腺炎（SAP），给社会经济带来了巨大负担[17][18][19]。急性胰腺炎向重症急性胰腺炎的进展特征是细胞因子风暴的失控释放，这会引发全身性炎症...

作者贡献声明

宋天娇：撰写初稿，争取资金。朱晨曦宇：撰写初稿。罗金权：撰写与编辑。陈黄：软件支持。陈立勋：方法学设计。柯俊：数据分析。林世荣：项目管理。陈峰：项目管理和数据分析。

出版同意

不适用。

伦理批准和参与同意

实验程序已获得福建省人民医院机构动物护理和使用委员会（IACUC-FPH-SL-20240220[0023）的审查和批准，确保符合伦理标准。

资助

本工作得到了以下项目的支持：福建省科技创新联合基金（项目编号：2023Y9328），以及福建省卫生科技项目（项目编号：2022ZD01008）的资助。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

我们感谢所有参与本研究的参与者，并感谢福建省急诊医学研究所和福建省急诊医学重点实验室的支持。