NDR2通过调控LC3与ATG9A介导的自噬体生成促进饥饿条件下非小细胞肺癌细胞迁移

《Cell Death Discovery》：NDR2 regulates non-small cell lung cancer cell migration under starvation by supporting autophagosome biogenesis through LC3 and ATG9A regulation

　　本研究针对非小细胞肺癌（NSCLC）在营养匮乏微环境中高迁移性的调控机制展开探索。研究人员发现Hippo激酶NDR2在血清剥夺条件下通过调控LC3表达和ATG9A的亚细胞定位，促进自噬体生物发生，进而维持高尔基体功能完整性，最终驱动NSCLC细胞的定向迁移。该研究揭示了NDR2-ATG9A轴在肿瘤代谢应激响应中的新功能，为靶向自噬相关转移途径提供了理论依据。

　　

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占病例的绝大多数。肿瘤微环境常常面临营养匮乏的挑战，如血清剥夺，癌细胞通过激活自噬等生存机制来适应这种应激条件。自噬是一把双刃剑：在肿瘤发生早期，它通过清除受损细胞器发挥抑制作用，但在已形成的肿瘤中，尤其是在缺氧、代谢应激等条件下，自噬却能够促进肿瘤的生长和转移。NSCLC的一个显著特征是具有高水平的基底自噬活性，这与其进展和不良预后相关。同时，Hippo信号通路的异常活化，特别是其下游效应器如 transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ) 和 Yes-associated protein 1 (YAP-1) 的激活，在NSCLC的侵袭和转移中扮演着关键角色。核Dbf2相关激酶2（NDR2）作为Hippo通路的一员，已被证实在乳腺癌等多种癌症中介导自噬和肿瘤进展，并促进NSCLC脑转移的形成。然而，NDR2在NSCLC自噬调控中的具体作用，特别是在营养应激条件下如何影响癌细胞迁移，仍是一个未被充分阐明的领域。这引出了一个核心科学问题：在饥饿应激下，NDR2是否以及如何通过调控自噬来驱动NSCLC细胞的迁移行为？为了解决这个问题，由Guénaelle Levallet团队领导的研究在《Cell Death Discovery》上发表了他们的最新发现。

研究人员主要运用了以下关键技术：利用人支气管上皮肿瘤细胞（HBEC）系（H2030, H2030-BrM3, H1299）进行体外模型构建；通过小干扰RNA（siRNA）和短发夹RNA（shRNA）敲低NDR2和ATG9A表达；采用蛋白质免疫印迹（Western blot）、实时定量PCR（RT-PCR）和免疫荧光技术分析蛋白和基因表达及定位；使用氯喹（CQ）抑制自噬流；通过CYTO-ID?染色和透射电子显微镜（TEM）观察自噬体和细胞超微结构；利用伤口愈合实验分析细胞迁移能力和高尔基体定向；并对45例NSCLC患者（25例非转移性，20例转移性）的肿瘤组织样本进行免疫组织化学（IHC）分析。

RESULTS

血清剥夺24小时降低NDR1但不降低NDR2表达

研究人员首先发现，24小时的血清剥夺（FBS starvation）能够诱导HBEC细胞自噬，但并未引起细胞凋亡，仅导致细胞增殖减缓。在mRNA水平上，血清剥夺对NDR1和NDR2的表达没有显著影响。然而，在蛋白质水平上，血清剥夺显著降低了NDR1的表达，却稳定甚至增加了NDR2的蛋白水平。当使用siRNA或shRNA敲低NDR2后，即使在血清剥夺条件下，NDR1的蛋白水平也进一步下降，表明NDR2的缺失无法由NDR1功能代偿。进一步研究表明，血清剥夺条件下NDR2的激活可能不依赖于经典的Hippo激酶MST1/3（因为它们的表达被抑制），而是通过非经典途径调控YAP-1的活性。

NDR2通过增加LC3-II水平促进HBEC自噬诱导

为了探究NDR2在自噬中的作用，研究人员使用了自噬溶酶体融合抑制剂氯喹（CQ）。结果显示，CQ处理增加了自噬体的积累，而血清剥夺进一步增强了这一效应。然而，NDR2的敲低显著减少了在基础条件下、CQ处理后以及血清剥夺+CQ联合处理下的自噬体数量。对自噬关键标志物微管相关蛋白轻链3（LC3）的分析表明，NDR2敲低降低了LC3的mRNA和蛋白水平（包括LC3-I和LC3-II），并减少了LC3斑点的形成。值得注意的是，NDR2敲低并未改变LC3-II与LC3-I的比值，说明NDR2不影响LC3的脂化过程，而是可能调控LC3的总体表达水平。在24小时血清剥夺的时间动力学实验中，对照细胞中LC3和LC3-II水平在初期（3小时）下降后出现回升，而NDR2敲低细胞的这种回升延迟且水平较低。此外，NDR2敲低影响了自噬底物SQSTM1/p62的蛋白水平，但其效应因细胞系而异。这些数据表明，NDR2参与调控血清剥夺诱导的自噬，特别是通过影响LC3的表达。

NDR2防止HBEC中溶酶体和聚集体的积累

NDR2敲低导致HBEC细胞中出现大的空泡状结构，LysoTracker染色和透射电镜（TEM）证实这些结构主要是溶酶体以及未降解的超密聚集体。这表明NDR2的缺失破坏了溶酶体的运输和/或与自噬体的融合，导致货物降解受阻。免疫荧光显示NDR2与SQSTM1/p62蛋白空间位置相近但未严格共定位，提示NDR2不直接位于自噬体上，而是间接调控自噬过程。

ATG9A在HBEC中的亚细胞定位转变依赖于NDR2

自噬相关蛋白9A（ATG9A）是一种定位于高尔基体、内吞体等膜结构的跨膜蛋白，对于自噬体形成的早期阶段——吞噬泡（phagophore）的扩增至关重要。在正常培养条件下，ATG9A主要位于高尔基体区域。血清剥夺诱导ATG9A从高尔基体向细胞质中转运，形成分散的囊泡，这与自噬体数量增加相一致。然而，在NDR2敲低的细胞中，无论是否存在血清剥夺，ATG9A均均匀分布于高尔基体和细胞质中，失去了应激诱导的重新定位。免疫共沉淀实验证实了NDR2与ATG9A之间存在物理相互作用。值得注意的是，ATG9A的氨基酸序列中包含NDR2的共识磷酸化 motif（HxRxxS/T），提示NDR2可能通过磷酸化ATG9A来调控其囊泡运输。同时敲低NDR2和ATG9A对SQSTM1/p62蛋白水平和斑点数量的影响与单独敲低NDR2相似，没有叠加效应，支持它们作用于同一通路。

NDR2和ATG9A维持高尔基体的完整性

NDR2或ATG9A的敲低均导致了高尔基体结构的碎片化。在对照细胞中，高尔基体呈现凝聚或延伸状态；而NDR2敲低后，无论在正常还是血清剥夺条件下，高尔基体碎片化的细胞比例显著增加。ATG9A敲低也引起类似但程度较轻的高尔基体碎片化。用氯喹（CQ）抑制自噬同样引起高尔基体碎片化，提示自噬缺陷可能是导致高尔基体结构异常的原因。高尔基体作为细胞内膜运输的中心枢纽，其结构的完整性对于自噬所需的膜脂和蛋白质供应至关重要。

NDR2-ATG9A调控H2030细胞的迁移特性

伤口愈合实验表明，血清剥夺降低了HBEC细胞的迁移速度和高尔基体向迁移前沿的定向重排（定义为高尔基体位于细胞核朝向伤口90度角范围内）。NDR2或ATG9A的敲低进一步显著减少了具有定向高尔基体的细胞比例，并降低了细胞迁移速度。抑制自噬（CQ处理）也降低了迁移速度，其效应与NDR2敲低类似，且CQ处理NDR2敲低细胞没有产生额外影响，说明NDR2和ATG9A可能通过调控自噬来促进细胞迁移。此外，NDR2和/或ATG9A的缺失减少了膜定位的N-钙粘蛋白（N-cadherin），使其在核周区域积累，这可能影响了细胞间的粘附特性。细胞骨架分析显示，NDR2敲低影响了丝状伪足（filopodia）的形成，但不改变波形蛋白（vimentin）或微管蛋白（tubulin）的整体结构。

讨论与结论

本研究揭示了NDR2激酶在NSCLC细胞应对血清剥夺应激中的一个新颖且关键的作用。研究发现，在营养匮乏条件下，NDR1蛋白表达被抑制，而NDR2则被稳定或激活，成为调控自噬的主要NDR激酶。NDR2通过一个涉及LC3和ATG9A的间接机制促进自噬。具体而言，NDR2可能通过调控YAP-1等转录因子影响LC3的表达，并通过与ATG9A相互作用，磷酸化其特定位点，从而指导ATG9A囊泡从高尔基体向吞噬泡形成位点的运输，这对于自噬体的正常生成至关重要。NDR2或ATG9A的缺失会导致ATG9A的错误定位、高尔基体碎片化、自噬体生成减少以及溶酶体 cargo 降解缺陷。

更重要的是，本研究将NDR2-ATG9A轴的功能与癌细胞的迁移行为联系起来。在迁移过程中，细胞需要建立前端-后端极性，其中高尔基体向细胞前缘的重排对于定向分泌和细胞运动至关重要。NDR2和ATG9A的缺失破坏了饥饿条件下高尔基体的定向重排，并显著抑制了细胞迁移。这种迁移缺陷可能与自噬过程受损导致的粘附斑（focal adhesion）和整合素（integrin）等迁移相关分子的循环利用障碍有关，类似于在其他研究中观察到的现象。

综上所述，这项研究阐明了NDR2在NSCLC中一种不依赖于经典Hippo通路的全新功能：响应营养应激，通过调控LC3和ATG9A促进自噬，进而维持高尔基体功能完整性和驱动细胞迁移。NDR2-ATG9A通路是连接营养匮乏、自噬激活和癌细胞迁移的重要桥梁。这些发现不仅增进了我们对NSCLC进展机制的理解，而且提示NDR2和/或ATG9A可能作为预测NSCLC转移潜能的生物标志物，以及未来开发针对肿瘤代谢应激适应和转移干预策略的潜在靶点。