CX3CL1缺失通过抑制巨噬细胞线粒体功能障碍及mtDNA-cGAS-STING信号通路改善急性肾损伤

《Cell Death Discovery》：CX3CL1 deficiency ameliorates acute kidney injury by inhibiting macrophage mitochondrial dysfunction and mtDNA-cGAS-STING signaling

　　本研究针对急性肾损伤（AKI）高发病率与死亡率且缺乏有效疗法的临床难题，探讨了趋化因子CX3CL1在AKI中的作用机制。研究人员发现，CX3CL1缺失可通过稳定线粒体转录因子A（TFAM），减少线粒体DNA（mtDNA）泄漏，进而抑制cGAS-STING通路活化，促进巨噬细胞向抗炎M2表型极化，最终改善线粒体功能并减轻肾脏损伤。该研究为AKI的免疫代谢调控提供了新见解，提示CX3CL1是潜在治疗靶点。

　　

急性肾损伤（Acute Kidney Injury, AKI）是一种在重症监护病房中发病率超过50%的高死亡率临床综合征，尤其以脓毒症引起的AKI最为凶险。尽管其临床意义重大，但目前尚缺乏特异性的有效治疗手段，这促使科学家们不断探索新的治疗策略。在AKI复杂的发病机制中，免疫调节被认为是一个充满希望的方向，其中肾脏驻留的巨噬细胞扮演着核心角色。这些巨噬细胞就像战场上的士兵，可以根据环境信号极化为两种主要类型：促进炎症的M1型（好比“攻击手”）和抑制炎症、促进修复的M2型（好比“修复师”）。如何促使巨噬细胞从M1型向M2型转化，是治疗AKI的一个潜在突破口。与此同时，线粒体功能障碍也被认为是AKI的关键推手。线粒体作为细胞的“能量工厂”，其功能紊乱会导致能量危机、活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）爆发，甚至引发细胞死亡。更为重要的是，受损的线粒体会将其自身的遗传物质——线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）释放到细胞质中。这些“流浪”的mtDNA会被一种名为cGAS的传感器识别，进而激活一条名为cGAS-STING的信号通路，这把“火”会进一步加剧炎症反应，形成恶性循环。然而，是什么因素启动了巨噬细胞的线粒体功能障碍，并将其与炎症极化联系起来，仍然是一个未解之谜。

趋化因子CX3CL1（又称Fractalkine）在肾脏巨噬细胞中高表达，并且与多种肾脏疾病的炎症反应密切相关。先前的研究表明，抑制CX3CL1对糖尿病肾病、狼疮性肾炎等有治疗益处，但它在AKI中，特别是如何调控巨噬细胞极化和线粒体功能，尚不清楚。为了解决这些问题，龚启明（Qiming Gong）、刘发辉（Fahui Liu）等研究人员在《Cell Death Discovery》上发表了一项研究，深入探讨了CX3CL1在AKI中的具体作用和分子机制。

为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术方法。他们构建了CX3CL1基因敲除（Knockout, KO）小鼠，并利用脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）腹腔注射诱导建立AKI模型，以模拟脓毒症引起的肾脏损伤。通过检测血清肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）水平评估肾功能，并利用组织切片染色（H&E和PAS）进行病理学评分。他们采用RNA测序（RNA-Seq）和生物信息学分析（如GSEA、CIBERSORT算法）来探索CX3CL1缺失对肾脏整体转录组和免疫细胞浸润，特别是巨噬细胞亚群的影响。在细胞层面，他们使用小鼠RAW264.7巨噬细胞系，通过慢病毒转染进行CX3CL1基因敲低（si-CX3CL1），并用LPS刺激模拟炎症环境。线粒体功能是研究的重点，他们通过透射电子显微镜观察线粒体超微结构，使用MitoTracker、MitoSOX、TMRM、mPTP等多种荧光探针分别评估线粒体形态、线粒体ROS、线粒体膜电位和线粒体通透性转换孔开放情况。此外，还通过Western blot检测线粒体电子传递链（ETC）复合物蛋白表达、Seahorse能量代谢分析仪检测细胞耗氧率（OCR）来全面评价线粒体呼吸功能。为了阐明信号通路，他们检测了cGAS-STING通路关键蛋白（cGAS, STING, p-TBK1, p-IRF3）以及线粒体转录因子A（TFAM）的表达和定位，并利用siRNA干扰技术验证了TFAM和CX3CR1在其中的关键作用。

CX3CL1缺失改善LPS诱导的AKI小鼠肾功能并减轻病理损伤

研究人员首先证实，在LPS诱导的AKI小鼠模型中，CX3CL1的表达显著上调。与对照组相比，AKI小鼠表现出严重的肾功能障碍（Scr和BUN水平升高）和肾脏组织学损伤（肾小管上皮细胞坏死）。然而，CX3CL1基因敲除显著改善了这些指标，降低了肾损伤分子-1（Kim-1）和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）等损伤标志物的表达，同时减轻了肾脏的炎症反应（如肿瘤坏死因子-α [TNF-α] 水平下降）。这表明CX3CL1的缺失对AKI具有保护作用。

RNA测序揭示肾脏巨噬细胞与CX3CL1在AKI中的关联

通过对肾脏组织进行RNA测序，研究人员发现CX3CL1缺失显著改变了AKI肾脏的基因表达谱。分析显示，CX3CL1敲除后，与抗炎M2型巨噬细胞相关的基因（如Il10, Arg1, Mrc1）表达上调，而与促炎M1型巨噬细胞相关的基因（如il-1β, il-6, cd86）表达下调。基因集富集分析（GSEA）进一步表明，CX3CL1缺失富集了与线粒体呼吸链复合物组装、细胞色素c氧化酶组装等相关的通路。免疫细胞浸润分析（CIBERSORT）证实，CX3CL1敲除减少了肾脏中M1型巨噬细胞的浸润，同时增加了M2型巨噬细胞的浸润。这提示CX3CL1通过调控巨噬细胞的极化状态参与AKI进程。

抑制CX3CL1促进AKI中巨噬细胞向抗炎表型转化

为了直接验证CX3CL1对巨噬细胞极化的影响，研究者在体内和体外进行了检测。在AKI小鼠肾脏和LPS刺激的RAW264.7细胞中，CX3CL1缺失或敲低均导致M1型标志物（CD86, iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-6）表达下降，而M2型标志物（CD206, IL-10）表达上升。添加重组CX3CL1蛋白可以逆转CX3CL1敲低带来的保护效应。这些结果明确表明，抑制CX3CL1能够驱动巨噬细胞从促炎的M1表型向抗炎的M2表型转换。

抑制CX3CL1减轻AKI巨噬细胞中线粒体损伤和氧化应激

线粒体是CX3CL1作用的另一个关键靶点。研究发现，在AKI小鼠肾脏和LPS处理的巨噬细胞中，存在明显的线粒体损伤和氧化应激，表现为线粒体形态破碎、活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）水平升高、线粒体膜电位降低、线粒体通透性转换孔（mPTP）异常开放。而CX3CL1的缺失或敲低有效逆转了这些异常，改善了线粒体形态，降低了氧化应激水平，并提升了线粒体结构蛋白（如Tomm20）和抗氧化酶（SOD2）的表达。

抑制CX3CL1挽救AKI肾脏巨噬细胞中降低的线粒体电子传递链复合物表达和细胞耗氧

线粒体的核心功能是通过电子传递链（ETC）产生能量。研究显示，LPS刺激导致巨噬细胞中线粒体ETC复合物I-V的关键亚基（如NDUFB8, SDHB, MTCO1, UQCRC2, ATP5A）蛋白表达下降，其酶活性也显著降低。更重要的是，Seahorse能量代谢分析表明，LPS处理削弱了巨噬细胞的基线呼吸能力、最大呼吸能力、ATP产生能力和备用呼吸能力。CX3CL1敲低则显著恢复了ETC复合物的表达、活性和细胞的耗氧率，表明其改善了线粒体的能量代谢功能。

抑制CX3CL1维持AKI肾脏巨噬细胞中线粒体融合-分裂平衡

线粒体的形态通过持续的融合和分裂过程维持动态平衡。研究发现，AKI条件下，线粒体融合蛋白Mfn2和线粒体生物发生调控因子PGC-1α的表达下降，而分裂蛋白Drp1和Fis1的表达上升，导致线粒体趋向于碎片化。透射电镜观察也证实了线粒体嵴结构破坏等超微结构异常。CX3CL1的缺失有效恢复了PGC-1α和Mfn2的表达，抑制了Drp1和Fis1的过度活化，从而维护了线粒体的融合-分裂平衡和结构完整性。

抑制CX3CL1减轻AKI肾脏巨噬细胞中TFAM相关的mtDNA不稳定性

线粒体转录因子A（TFAM）对于维持mtDNA的稳定和包装至关重要。本研究发现在AKI条件下，TFAM的表达被抑制。CX3CL1缺失则能上调TFAM的蛋白和mRNA水平。免疫荧光共定位分析显示，CX3CL1敲除增强了TFAM与mtDNA（用双链DNA [dsDNA] 抗体指示）的共定位，提示mtDNA核样结构更稳定。相反，当用siRNA敲低TFAM后，会加剧LPS引起的mtDNA泄漏，而同时敲低CX3CL1则可以减轻这种泄漏。这表明CX3CL1通过调控TFAM来影响mtDNA的稳定性。

抑制CX3CL1上调BAX并抑制cGAS-STING介导的炎症信号

稳定的mtDNA被包裹在线粒体基质内，而当线粒体外膜通透性增加时，mtDNA会泄漏到细胞质中。研究显示，AKI中促凋亡蛋白BAX的表达增加，这可能促进了外膜通透。泄漏的mtDNA随后激活cGAS-STING通路，表现为cGAS、STING蛋白以及其下游磷酸化TBK1（p-TBK1）和磷酸化IRF3（p-IRF3）的水平升高。重要的是，CX3CL1的缺失或敲低显著抑制了BAX的表达以及整个cGAS-STING信号通路的活化。免疫荧光也显示CX3CL1抑制减少了BAX、cGAS和STING蛋白之间的共定位。

CX3CR1抑制在LPS诱导的RAW264.7细胞中促进抗炎表型并减轻线粒体损伤

CX3CL1主要通过其唯一受体CX3CR1发挥作用。为了验证该轴线的功能，研究人员敲低了巨噬细胞中的CX3CR1。结果发现，CX3CR1沉默同样能够促进巨噬细胞向M2型极化，并缓解LPS诱导的线粒体动力学失衡（提升PGC-1α、Mfn2、SOD2，降低Drp1、Fis1）。这证实了CX3CL1/CX3CR1轴在调控巨噬细胞功能和线粒体稳态中的关键作用。

TFAM在CX3CL1缺失介导的巨噬细胞极化和线粒体功能调控中起关键作用

最后，为了确认TFAM是否是CX3CL1下游不可或缺的效应分子，研究者在敲低CX3CL1的同时也敲低了TFAM。令人惊讶的是，TFAM的缺失几乎完全逆转了CX3CL1敲低所带来的所有益处：巨噬细胞重新极化为M1表型，线粒体功能改善效应（如PGC-1α、Mfn2上调，Drp1、Fis1下调）被取消，氧化应激标志物SOD2水平下降，并且被抑制的cGAS-STING通路重新被激活。这一系列实验强有力地证明，TFAM是CX3CL1调控巨噬细胞炎症状态和线粒体功能的核心中介分子。

综上所述，这项研究系统地阐明了CX3CL1在AKI中的一个新颖且重要的机制。CX3CL1的上调会损害巨噬细胞的线粒体功能，特别是通过抑制TFAM导致mtDNA不稳定并泄漏至胞质，进而激活cGAS-STING通路，从而驱动巨噬细胞向促炎的M1表型极化，加剧肾脏炎症和损伤。反之，抑制CX3CL1则能稳定TFAM，保护mtDNA，阻断cGAS-STING通路的异常活化，并促进巨噬细胞向修复性的M2表型转换，最终减轻AKI。该研究不仅深化了对AKI免疫代谢机制的理解，更重要的是将CX3CL1确立为一个连接炎症反应和线粒体功能障碍的关键分子节点，为开发针对AKI的靶向治疗策略提供了强有力的理论依据和新的潜在靶点。