基于qPCR靶向基因组差异序列检测耐药性毛癣菌Trichophyton indotineae的创新方法

　　编辑推荐：针对耐药性毛癣菌Trichophyton indotineae与近缘种难以区分的诊断难题，伊斯坦布尔大学团队通过全基因组比对发现22个独特序列，开发出靶向499 bp稳定区域的qPCR检测方法，灵敏度93.3%、特异性100%，为临床提供快速精准的分子诊断方案。

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近年来，一种名为Trichophyton indotineae（原T. mentagrophytes ITS基因型VIII）的耐药性皮肤癣菌在全球范围内引发公共卫生危机。这种病原体不仅具有高致病性，更因对一线抗真菌药物特比萘芬（terbinafine）的广泛耐药性而难以治疗。更棘手的是，传统实验室鉴定方法面临巨大挑战——该菌种与T. mentagrophytes、T. interdigitale在形态学特征上高度相似，且核糖体DNA内转录间隔区（ITS）序列相似度高达99%，常规分子检测难以准确区分。随着亚洲、中东、欧洲和美国等地疫情持续扩散，开发快速、特异的诊断工具成为当务之急。

针对这一难题，来自伊斯坦布尔大学和丘库罗瓦大学的研究团队在《Mycopathologia》发表创新成果。研究人员突破传统ITS靶向检测的局限，通过全基因组比较分析发现22个T. indotineae特有序列，并开发出基于定量PCR（qPCR）的高特异性检测方法。该研究不仅为临床诊断提供新工具，更开创了不依赖SNP（单核苷酸多态性）设计的病原体检测新策略。

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研究团队采用多组学技术联用的方法体系：首先收集73株临床分离株（含66株T. indotineae）建立样本队列，通过MLST（多位点序列分型）确认菌种身份；随后运用MAFFT和Mauve软件对T. indotineae（GCA_023065905.1）与T. interdigitale（GCA_037576225.1）参考基因组进行比对，筛选长度>150 bp的独特序列；最终针对最显著的499 bp差异区域（位于JAJVHL010000003.1:1,936,972-1,937,471）设计特异性引物Tindo_F/Tindo_R，建立SYBR Green荧光定量检测体系，并通过熔解曲线分析、灵敏度测试和交叉反应验证进行方法学评价。

全基因组比较揭示关键差异
通过系统比较8个T. indotineae基因组与近缘种参考基因组，研究发现传统分子标记（如ACT、TUB2、Tefl-α等）的序列相似度高达99.4-100%，无法满足鉴别需求。而全基因组分析在T. indotineae参考基因组中鉴定出22个特有序列，其中59%位于JAJVHL010000001.1 contig。BLAST验证显示这些序列在T. interdigitale、T. rubrum等近缘种中完全缺失，而选定的499 bp区域与T. benhamiae、T. schoenleinii的相似度分别仅为77%和88%，具备高度特异性。

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qPCR方法学验证表现卓越
新开发的检测体系产生445 bp扩增产物，熔解温度稳定在74±0.5°C。在73株测试菌株中，灵敏度达93.3%（66株阳性中检出62株），且与所有非目标菌株（含人源DNA）无交叉反应。方法检测限低至15个基因组拷贝（Ct值35-38），扩增效率84.6%（R²=0.997），重复性测试显示1000拷贝和15拷贝的变异系数分别为1.5%和2.5%。相比现有技术，该方法成本仅3美元/测试，2小时内即可完成检测。

这项研究开创性地通过全基因组扫描策略突破传统分子标记的局限。其重要意义体现在三个方面：首先，建立的qPCR检测为临床提供快速（2小时）、经济（3美元/测试）且可靠的诊断方案，尤其适合发展中国家推广应用；其次，研究证实全基因组比较可作为新兴病原体诊断标记开发的有效路径，这对缺乏公共数据库支持的新发传染病防控具有普适价值；最后，发现的22个独特序列为后续耐药机制研究和分子流行病学监测奠定基础。随着T. indotineae全球流行态势持续加剧，该成果将为临床决策、治疗方案优化和感染控制提供重要技术支撑。

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