《Applied Microbiology and Biotechnology》：CRISPR-Cas9 engineered Saccharomyces cerevisiae for endolysin delivery to combat Listeria monocytogenes
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为解决单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）引发的食源性疾病问题，研究人员开展了利用 CRISPR-Cas9 技术改造酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表达内溶素 Ply511 的研究。结果显示，酵母分泌的内溶素能显著降低李斯特菌数量。该研究为控制李斯特菌感染提供了新策略。
在食品安全的大舞台上，单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，简称 L. monocytogenes）可是个让人头疼的 “反派角色”。它常常隐藏在各种食物中，从即食产品到新鲜农产品，再到奶制品，无孔不入。一旦人们误食被它污染的食物，就可能引发严重的疾病，像发热性肠胃炎、中枢神经系统感染，甚至可能导致死亡，尤其是对于一些高风险人群，它更是 “致命杀手”。
目前，食品行业虽然已经采取了很多措施来保障食品安全，比如巴氏杀菌、冷藏以及使用防腐剂等，可 L. monocytogenes 却很 “顽强”，能在低温环境下存活，还常常潜伏在加工厂里，让这些常规手段难以完全将其 “制服”。同时，治疗李斯特菌病常用的抗生素，也面临着严峻的挑战，因为已经出现了具有抗生素耐药性的李斯特菌菌株。所以，寻找新的防控策略迫在眉睫。
在这样的背景下，来自葡萄牙米尼奥大学（University of Minho）CEB 生物工程中心等研究机构的研究人员，开展了一项极具意义的研究。他们将目光聚焦在一种被称为内溶素（endolysin）的神奇物质上，尤其是能对抗李斯特菌的 Ply511 内溶素。研究人员利用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术，对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，简称 S. cerevisiae）进行改造，让其能够表达 Ply511，期望借助酵母这个 “安全卫士”，在食品生产和储存过程中，有效对抗李斯特菌，保障食品安全。这项研究成果发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》杂志上。
研究人员在这项研究中用到了几个关键技术方法。首先是利用 CRISPR-Cas9 技术，将表达 Ply511 的基因整合到酿酒酵母的基因组中。接着，通过构建多种质粒，用于不同形式的 Ply511 表达，如表面展示和分泌表达。在检测 Ply511 的活性时，采用了共培养实验、酶活性检测等方法，评估改造后的酵母对李斯特菌的抑制效果 。
下面来看看具体的研究结果：
- 构建多种新型 Ply511 展示酵母菌株：研究人员使用 CRISPR-Cas9 技术，将内溶素表达盒整合到酿酒酵母的不同染色体位点（X、XI 和 XII），构建了多种表达 Ply511 的酵母菌株。经过检测，发现除了携带三重整合表达盒的菌株生长受到显著影响外，其他构建菌株与野生型菌株在生长上没有明显差异。
- V5 表位可检测并作为酵母表面蛋白表达的指标：为了确认 Ply511 在酵母表面的有效展示，研究人员在融合蛋白中添加了 V5 表位标签。通过荧光显微镜观察，发现标记的细胞在酵母细胞壁上均匀显示出目标蛋白，证明了 Ply511 在酵母表面的成功展示。
- 展示内溶素 Ply511 的酿酒酵母具有酶活性：研究人员通过在含有热灭活李斯特菌的平板上进行实验，发现重组酵母能够降解李斯特菌的肽聚糖层，使周围的不透明表面变清，这表明展示在酵母表面的 Ply511 保留了肽聚糖降解功能，且对所有测试的李斯特菌血清型都有活性。
- 展示内溶素 Ply511 的酿酒酵母没有抗菌活性且生长受损：在共培养实验中，研究人员发现无论酵母中整合的表达盒拷贝数、缓冲液类型、李斯特菌的生长阶段以及锚定蛋白如何变化，展示 Ply511 的酵母都无法有效降低李斯特菌的数量，而且李斯特菌在与酵母共培养的 24 小时内持续生长。
- Ply511 分泌盒三重整合的酿酒酵母不影响酵母生长：为了提高酿酒酵母的抗李斯特菌活性，研究人员去掉了 Sed1 锚定序列，设计了分泌型 Ply511 表达盒，并将其整合到酵母的三个染色体位点上。结果发现，分泌内溶素的酵母在生长上没有受到影响，与野生型酵母的生物量生长速率相似。
- 分泌 Ply511 的酿酒酵母在共培养中对单核细胞增生李斯特菌有活性：共培养实验表明，分泌内溶素的重组酵母在接触 24 小时后，能够显著降低李斯特菌血清型 4c 的水平，展现出良好的抗菌效果。
- 分泌 Ply511 的酿酒酵母的上清液显示出抗李斯特菌的杀伤活性：研究人员对分泌 Ply511 的酵母上清液进行检测，发现浓缩 10 倍的上清液在 6 小时内，对李斯特菌血清型 1/2c、4b 和 4c 的数量分别降低了 1.3 log10（CFU/mL）、4.2 log10（CFU/mL）和 1.7 log10（CFU/mL），相比野生型酵母上清液，抗菌活性显著提高。
- 上清液在牛奶中显示出抗李斯特菌的杀伤活性：考虑到牛奶是易受李斯特菌污染的食品，研究人员在牛奶中进行实验。结果发现，虽然李斯特菌在牛奶中能够生长，但分泌 Ply511 的酵母上清液在 48 小时内，可使李斯特菌 CFU/mL 降低 80%，且差异具有统计学意义。
- 酵母细胞提取物中抗李斯特菌的杀伤活性提高：研究人员对酵母细胞进行机械裂解，得到酵母提取物。实验显示，野生型酵母提取物支持李斯特菌生长，而工程酵母提取物则能显著降低李斯特菌细胞数量，对血清型 1/2c 和 4b 的李斯特菌甚至能使其数量降至检测限以下，对血清型 4c 的李斯特菌在 24 小时后平均降低 6.5 log10（CFU/mL）。
综合研究结果和讨论部分，这项研究意义重大。它首次证明了利用 CRISPR-Cas9 技术改造的酿酒酵母可以表达具有活性的 Ply511 内溶素，并且分泌型的酵母及其相关产物（上清液和细胞提取物）能够有效对抗李斯特菌。这为食品生物保鲜和病原体生物防治提供了新的策略，有望应用于食品生产和储存过程中，减少李斯特菌污染，保障食品安全。同时，这种基于酵母的平台还具有潜在的拓展性，未来可以进一步研究其在对抗其他肠道相关病原体方面的作用，为提升食品安全和公众健康水平开辟新的道路。
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