AAV5 在临床试验中应用最为频繁，因其被抗体识别和中和的风险较低，人群中抗 AAV 中和抗体（NAB）的血清阳性率估计在 3% - 40% 之间 。研究表明，即使 B 型血友病患者体内存在循环的抗 AAV5 抗体，因子 IX 的转导依然有效且不受影响。用于治疗血友病的基因疗法使用基于重组腺病毒（rAAV）的载体，去除了野生型病毒编码序列，以降低引发针对外来病毒蛋白的细胞免疫反应的可能性 。载体中的 rep 和 cap 序列被单链转基因表达盒取代，该表达盒包含治疗基因（因子 VIII 或因子 IX）和转录调节元件（如启动子序列），以增强转基因在特定细胞（尤其是肝细胞）中的表达。表达盒两侧是回文反向末端重复序列，可实现转录。载体与肝细胞结合后，通过内吞作用进入宿主细胞，衣壳被降解，转基因释放并形成游离于宿主细胞核外的附加体 DNA，能够在非分裂细胞中稳定、长期表达转基因，且不会损伤靶细胞。随后，载体单链 DNA 的互补链合成，产生功能性凝血因子 VIII 或 IX 。例如，给 B 型血友病患者单次注射 scAAV8 - co F9 载体后，因子 IX 蛋白的稳定表达可持续超过 11 年。
基于基因疗法的 B 型血友病治疗药物 etranacogene dezaparvovec 应运而生，它包含靶向肝细胞的重组 AAV 血清型 5 载体和经过密码子优化的人因子 IX 基因（Padua） 。III 期研究证实，单次静脉输注后，因子 IX 至少能持续 18 个月内源性表达。后续报告显示，输注后 2 年内患者的年出血率降低了 64%，且无需使用含因子 IX 的预防制剂 。长期分析预测，单次全剂量给药后，因子 IX 的表达可持续长达 25 年，为 B 型血友病患者带来了新的希望。
在人类中发现的 IX - R338L 突变（Padua）是 B 型血友病基因治疗的重大突破。该突变是指在因子 IX 的催化结构域中，第 338 位的精氨酸被亮氨酸取代，从而使因子 IX 的活性增加 。因子 IX - R338L 的特异性活性增强，源于其与辅因子因子 VIIIa 的相互作用增加。活化的因子 IX（IXa）与活性因子 VIII（VIIIa）形成的酶复合物，对因子 X 的蛋白水解激活和内源性凝血途径至关重要 。动物的临床前研究表明，FIX - R338L 与野生型 FIX（FIX - WT）的免疫原性和血栓形成性相当，且未观察到因与 FIX - WT 交叉反应而产生抗体的情况 。重组 IX - R338L 的特异性活性比未突变的 FIX - WT 高 8 - 12 倍 。这一发现对 AAV 介导的 B 型血友病基因治疗的疗效至关重要，低剂量的载体即可诱导治疗性因子 IX 的表达，同时降低了针对衣壳蛋白的细胞免疫反应风险。使用 Padua 变体的 AAV 基因治疗，与使用 FIX - WT 的研究相比，治疗载体剂量可减少四倍，而因子 IX 活性水平可提高六倍。
六、基因疗法后的抑制剂问题
B 型血友病基因疗法的疗效在很大程度上取决于对转基因产物、基因改造细胞和 / 或载体的不良免疫反应的控制。其中，抑制剂（尤其是中和抗体）的产生是最为令人担忧的问题 。动物模型研究显示，基因治疗后产生抑制剂的风险通常较低。在使用高功能因子 IX（FIX - Padua，精氨酸 338 变为亮氨酸）的犬类 B 型血友病模型的临床前研究中，基因转移后 FIXR338L 的表达并未导致抑制剂的形成，反而发现肝脏转基因表达清除了中和抗体（FIX 抑制剂）并诱导了免疫耐受 。同样，在小鼠模型中也证明，肝脏靶向的基因治疗可诱导对人 FIX 的免疫耐受，有效消除预先存在的高滴度抑制剂。这两种现象都依赖于调节性 T 细胞（Treg）的活性，以及血浆和针对 FIX 的记忆 B 细胞的减少 。对 7 名接受 AAV2 - hFIX16 治疗的严重 B 型血友病患者中的 4 名进行长期随访发现，在 12 - 15 年的随访期间，没有患者出现 FIX 抑制剂的迹象，但输注 15 年后仍可检测到针对多种 AAV 血清型的高滴度抗体 。需要注意的是，临床试验通常会排除目前存在或有过抑制剂病史的参与者，以降低抑制剂产生的风险。
七、基因疗法的未来发展
B 型血友病的基因治疗发展前景广阔，除了基于病毒载体的基因疗法，还有许多创新方法正在探索中。
Fitusiran 是一种合成干扰 RNA（siRNA），与 GalNAc 配体结合后，可靶向抗凝血酶（AT）的信使 RNA（mRNA） 。其作用机制是切割 AT mRNA，抑制翻译过程和蛋白质合成。AT 是一种抗凝酶，被肝素激活后可中和因子 X 和凝血酶等。间接来说，fitusiran 可提高凝血酶水平，恢复 B 型血友病患者的体内平衡 。目前，fitusiran 的研究处于 3 期，已取得了有前景的结果。此外，针对蛋白 S 和肝素 II 辅因子的 siRNA 疗法也在临床前研究阶段。
基因编辑方法在动物模型中也得到了测试，CRISPR/Cas 系统是目前应用最广泛的策略，此外还有转录激活样效应核酸酶（TALEN）和锌指核酸酶（ZFN）等方法 。CRISPR/Cas 系统由编码核酸酶的 Cas 基因和位于整合到 DNA 中的病毒序列之间的短回文重复序列（CRISPR）组成，具有操作简单、成本效益高的优点 。动物实验主要是利用 CRISPR/Cas 系统对从患者体内分离的诱导多能干细胞（iPSCs）进行基因编辑，将其分化为肝细胞或成体内皮细胞，然后使用 AAV 载体将其导入体内。目前，基因编辑研究仍在不断推进，新的方法也在持续探索中。
八、结论
欧洲药品管理局（EMA）批准了 etranacogene dezaparvovec 疗法，这使得期待已久的基于病毒载体的 B 型血友病基因疗法成为现实，该疗法已用于治疗中重度成年 B 型血友病患者 。尽管最初人们对其潜在副作用存在担忧，但实践证明这种疗法非常成功，为进一步提高患者生活质量的替代和创新项目开辟了道路。随着研究的不断深入，未来有望出现更安全、更有效的基因治疗方法，为 B 型血友病患者带来更好的治疗效果和生活质量。
