《Journal of Biological Engineering》：Engineering the T6SS of Pseudomonas for targeted delivery of antibacterial and antifungal effectors
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为解决微生物竞争及抗菌策略问题，研究人员开展了对假单胞菌 T6SS 进行工程改造的研究。结果显示成功改造的菌株能表达释放 T6SS 效应物，具备抗菌、抗真菌活性。该研究为生物防治、微生物组调节等提供了新策略。
在奇妙的微生物世界里，细菌们为了生存和 “称霸”，可谓是各显神通。它们不断地竞争资源、抢夺生存空间，发展出了各式各样的 “秘密武器”。其中，
VI 型分泌系统（T6SS）就是革兰氏阴性菌中一种十分厉害的 “纳米武器”，它能将有毒的效应物直接输送到邻近细胞，在细菌间的 “战争” 中发挥关键作用。
近年来，抗生素耐药问题日益严重，传统抗菌策略逐渐面临挑战。为了寻找更有效的抗菌方法，研究人员把目光投向了 T6SS，期望通过工程改造它，开发出新型的抗菌平台。在这样的背景下，来自西班牙马拉加大学 - 西班牙科学研究委员会亚热带和地中海园艺研究所（IHSM-UMA-CSIC）等机构的研究人员展开了深入研究 ，其相关成果发表在《Journal of Biological Engineering》上。
研究人员主要运用了基因工程技术、蛋白 - 蛋白相互作用的计算机分析技术、活性氧（ROS）水平测定技术、透射电子显微镜（TEM）技术等。通过构建表达不同效应物的质粒，并将其导入假单胞菌中，观察其对不同微生物的作用；利用计算机工具预测蛋白间的相互作用；借助特定染色剂和显微镜测定 ROS 水平，以及通过 TEM 观察细胞结构变化。
研究结果主要包括以下几个方面：
- 工程改造的假单胞菌诱导芽孢杆菌孢子形成：研究人员将来自绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）的效应物 Tse1 在恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440 中异源表达。实验发现，当 Tse1 与 PAAR 蛋白共表达时，能显著诱导植物有益芽孢杆菌的孢子形成，且这种诱导作用依赖 T6SS。这表明工程改造的 KT2440 可通过 T6SS 的活动诱导芽孢杆菌孢子形成，为调控微生物群落提供了新途径。
- 工程改造的假单胞菌通过 T6SS 依赖的异源毒素表达致使气单胞菌死亡：研究选取了铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1 中具有磷脂酶活性的毒素 TplE，将其与 KT2440 的 VgrG 蛋白组合。计算机模拟显示了它们之间的相互作用，实验结果也表明，表达 TplE 的 KT2440 能有效抑制嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的生长，且该抗菌活性依赖 T6SS。这说明 KT2440 可装备新型抗菌效应物，用于对抗革兰氏阴性菌。
- 表达 Tfe2 的工程 T6SS 对灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）具有抗真菌活性：为测试 T6SS 对真菌的作用，研究人员以灰葡萄孢菌为目标，选择了来自粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）的 Tfe2 效应物和两个孤儿 VgrG 蛋白。实验发现，单独表达 VgrG 或 Tfe2 时没有抗真菌效果，而两者共表达则会显著增加 ROS 产生，导致灰葡萄孢菌细胞死亡。这表明在 KT2440 中异源表达 VgrG 和 Tfe2 赋予了其抗真菌能力。
- 通过 T6SS 分泌非 T6SS 依赖的效应物：研究人员尝试将 T6SS 与非 T6SS 相关蛋白结合，选取了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的壳聚糖酶。构建表达壳聚糖酶与不同 VgrG 的质粒，导入 KT2440 后与灰葡萄孢菌进行竞争实验。结果显示，特定组合（如 VgrG250J 与壳聚糖酶）能降解灰葡萄孢菌的壳聚糖，且这种作用依赖 T6SS。这证明了 T6SS 可分泌非 T6SS 相关蛋白，增强抗真菌活性。
研究结论和讨论部分指出，该研究成功证明了工程改造恶臭假单胞菌 KT2440 作为 T6SS 效应物递送系统的可行性，它能分泌传统 T6SS 效应物和非 T6SS 相关蛋白，具备对抗细菌和真菌病原体的潜力。T6SS 的多功能性使其在生物防治、微生物生态系统调控、精准微生物工程等领域展现出广阔的应用前景，有望为可持续农业、环境管理和治疗发展提供新的解决方案。但同时，使用非经典 T6SS 效应物也存在一些限制，如分泌的大小限制、对递送细菌的内在毒性、在复杂环境中的稳定性问题等，未来还需要通过蛋白质工程和生物信息学的进一步发展来解决这些挑战 。
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