利用组合饱和诱变技术开发趋化因子网络抑制剂：开辟炎症性疾病治疗新路径

　　为解决趋化因子驱动的炎症因冗余通路难以靶向的问题，研究人员开展了利用组合饱和诱变优化策略（CoSMOS）开发趋化因子网络抑制剂的研究。结果发现 CoSMOS 能筛选出结合和抑制活性增强的肽，这为治疗免疫炎症性疾病提供了新方向。

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　　在人体的免疫系统中，趋化因子如同精密的 “导航员”，指挥着白细胞精准地奔赴炎症战场。它们组成了一个由 46 种结构相关的分泌蛋白构成的复杂网络，通过与白细胞上的 G 蛋白偶联趋化因子受体结合，激活白细胞的定向迁移，即化学趋化性（chemotaxis）。这个网络在多种免疫炎症性疾病，如动脉粥样硬化、1 型糖尿病、类风湿关节炎和炎症性肠病的发生发展中起着关键作用。

然而，趋化因子网络的冗余性却成为了治疗这些疾病的 “拦路虎”。炎症组织中多种趋化因子的表达、趋化因子与受体之间的 “一对多” 相互作用，以及每个白细胞亚类表达多种趋化因子受体，使得针对单个趋化因子或受体的治疗手段往往难以奏效。就好比敌人构建了多条备用道路，当你阻断一条时，它们能迅速通过其他道路继续前进。

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为了攻克这一难题，英国牛津大学（University of Oxford）的研究人员展开了深入研究。他们另辟蹊径，从蜱虫的唾液蛋白中获取灵感。蜱虫能够通过产生两类结构不同的唾液蛋白 —— 逃避素（evasins），来克服趋化因子网络的冗余性。A 类和 B 类逃避素分别可以结合并中和多种 CC 类和 CXC 类趋化因子，以 “一对多” 的方式抑制局部炎症，让蜱虫在叮咬时能长时间进食。但逃避素由于其结合特异性和潜在的免疫原性，并不适合直接用于临床治疗。

研究人员发现，从 A 类逃避素中分离出的 16 聚体肽具有同时结合和抑制 CC 类和 CXC 类趋化因子的能力，其中的先导肽 HD2 成为了他们研究的重点。基于此，研究人员开发了一种名为组合饱和诱变优化策略（Combinatorial Saturation Mutagenesis Optimization Strategy，CoSMOS）的新方法，旨在快速识别能够改善 HD2 肽功能的突变。

研究人员运用了多种关键技术方法。在实验中，他们构建了饱和诱变噬菌体展示文库，通过对 HD2 肽编码序列进行 NNK 突变，使每个位点都能引入 20 种不同的氨基酸，从而获得大量突变体。之后，利用噬菌体展示技术，对这些突变体进行多轮筛选，结合下一代测序技术分析突变体与趋化因子的结合情况。此外，还通过化学趋化性实验检测突变肽对细胞迁移的影响，并利用 AlphaFold 3 对肽 - 趋化因子相互作用进行结构建模分析。实验样本来自匿名捐赠者的外周血细胞。

NNK 诱变文库的构建和筛选

研究人员构建了 HD2 突变体文库，利用噬菌体展示技术，针对 22 种生物素化趋化因子进行平行筛选。他们通过计算突变体富集率（log₂E）来评估结合亲和力，发现多个突变（如 T6D、T6W、A7D 和 L11I）相较于亲本 HD2 肽，显著提高了 log₂E，表明这些突变能够改善趋化因子的结合能力。

点突变对化学趋化性的影响

研究人员选用 THP1 细胞、活化的 CD8⁺T 细胞和表达 CXCR1 的 Jurkat 细胞系，评估亲本 HD2 和选定的 HD2 突变肽对化学趋化性的影响。结果显示，多个突变体（如 Y5W、T6W、A9W、L11I、T16C）在抑制细胞迁移方面相较于亲本 HD2 肽有显著改善，其中 Y5W、T6W、A9W 和 T16C 在综合分析中表现最为突出。

组合诱变文库的构建和筛选

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为了寻找具有协同或加性效应的点突变组合，研究人员构建了包含所有可能的 16 个 “改善” 突变组合的文库，并针对 25 种商业可得的生物素化趋化因子进行噬菌体展示筛选。通过计算每个突变体的中位 Δlog₂E 来对数据进行排序，筛选出了具有不同结合特性的组合突变体，包括与所有趋化因子结合能力最强的（CM - max）、与 CC 趋化因子结合能力最强的（CM - maxCC）和与 CXC/CX3C 趋化因子结合能力最强的（CM - maxCXnC）。

组合突变体的功能分析

研究人员选取了不同组的组合突变肽（如 HD2CM307、HD2CM539 等）和点突变肽，利用化学趋化性实验评估它们对多种 CC 和 CXC 趋化因子诱导的细胞迁移的抑制作用。结果表明，部分组合突变肽（如 HD2CM307）在抑制趋化因子方面相较于点突变肽 HD2Y5W 有显著改善，且在针对疾病相关趋化因子池的实验中，多种组合突变肽能有效抑制原代白细胞和活化 T 细胞的迁移。

治疗应用潜力

研究人员针对动脉粥样硬化、类风湿关节炎和 1 型糖尿病，设计了疾病相关的趋化因子池，评估了亲本肽 HD2、其对照肽、选定的点突变体和组合突变体对这些趋化因子池诱导的细胞迁移的抑制效果。结果显示，组合突变肽（如 HD2CM307、HD2CM304 等）在抑制不同疾病趋化因子池诱导的细胞迁移方面表现出色，部分组合突变肽的抑制效果甚至超过了亲本逃避素 EVA4。剂量 - 反应实验表明，HD2CM304 在针对活化 T 细胞测试时，pIC₅₀显著高于亲本 HD2；HD2CM307 在针对 THP1 细胞和动脉粥样硬化趋化因子池测试时，pIC₅₀也有显著改善。

结构功能分析

研究人员利用 AlphaFold 3 构建了 46 种趋化因子与 HD2、HD2CM304 或 HD2CM307 的复合物模型。分析发现，HD2CM304 和 HD2CM307 与趋化因子形成的链间键总数显著超过 HD2，尤其是疏水键数量增加明显。进一步分析发现，HD2CM304 中 5 和 12 位的色氨酸（Trp）残基介导的疏水键形成增加，可能是其 pIC₅₀增强的原因。

趋化因子抑制机制

研究人员通过 AlphaFold 3 构建了趋化因子与同源受体以及趋化因子二聚体的模型，分析肽结合对趋化因子相互作用的影响。结果表明，HD2 和 HD2CM304 能够阻断大量趋化因子与受体结合以及趋化因子二聚化的相互作用，从而抑制免疫细胞迁移。

研究表明，CoSMOS 方法能够高效地筛选出结合和抑制活性增强的组合突变肽，这些肽在针对单个趋化因子和疾病相关趋化因子池的实验中都表现出良好的效果。结构功能分析揭示了突变肽增强活性的潜在机制，为进一步理解趋化因子抑制作用提供了理论依据。该研究为治疗多种免疫炎症性疾病提供了新的方向和潜在的治疗手段，有望推动相关疾病治疗药物的开发。同时，CoSMOS 方法具有广泛的应用前景，可用于快速识别针对其他具有冗余信号通路的疾病网络的组合突变肽，为生命科学和健康医学领域的研究开辟新的道路。

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