Pathogenic mutation impairs functional dynamics of Hsp60 in mono- and oligomeric states：从分子机制揭示疾病关联突变对 Hsp60 功能的影响
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为探究 V72I 突变对热休克蛋白 60（Hsp60）功能的影响机制，研究人员运用原子分子动力学（MD）模拟等技术，对野生型和突变型 Hsp60 进行研究。结果发现该突变重塑 Hsp60 动力学，影响其与伴侣蛋白的相互作用。这为理解 Hsp60 功能及相关疾病机制提供了新视角。
在细胞的微观世界里，蛋白质就像一个个精密的 “小机器”，执行着各种重要任务。热休克蛋白 60（Heat Shock Protein 60 kDa，Hsp60）便是其中一位关键 “成员”，它是线粒体中的分子伴侣，与 Hsp10 协同工作，帮助其他蛋白质正确折叠，对维持细胞内蛋白质稳态至关重要。一旦 Hsp60 出现异常，就可能引发多种疾病，如癌症、糖尿病、阿尔茨海默病等。
其中，遗传性痉挛性截瘫 13 型（SPG13）与 Hsp60 的 V72I 突变密切相关。然而，尽管知道这个突变会导致疾病，但它究竟如何影响 Hsp60 的功能，在分子层面的具体机制仍不明确。这就好比知道一把钥匙坏了打不开锁，但不清楚是钥匙的哪个齿出了问题。为了揭开这个谜团，来自意大利帕维亚大学化学系、美国加利福尼亚大学旧金山分校等机构的研究人员展开了深入研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。
研究人员采用了原子分子动力学（MD）模拟这一强大的技术手段。他们对 18 种不同的 Hsp60 复合物（9 种野生型，9 种 V72I 突变型）进行了多微秒时长的模拟，涵盖了从单体状态（M）到足球形复合物（F）的多种可能的寡聚组织状态。同时，运用最短路径图（SPM）、距离波动分析（DF）、主成分分析（PCA）等方法，对模拟结果进行分析。
Hsp60 V72I 突变对伴侣结构和功能的显著影响
研究人员首先通过实验，对野生型 Hsp60（Hsp60wT）、Hsp60222和Hsp60D3G进行生化表征。结果显示，Hsp60wT相对不稳定，Hsp60222是稳定的寡聚体，Hsp60D3G主要以单体形式存在。Hsp60V72I的稳态 ATP 酶活性略有升高，而Hsp60D3G活性降低。并且，Hsp10 能提升Hsp60的 ATP 酶活性，但对两种突变体的这种提升作用严重受损。此外，Hsp60V72I在重折叠变性苹果酸脱氢酶（MDH）的能力上也有所受损。这一系列实验结果表明，V72I 突变虽看似微小，却对 Hsp60 的结构、ATP 酶活性、与 Hsp10 的偶联以及蛋白重折叠功能产生了深远影响。
对单体 Hsp60 的影响
- 变构通讯网络改变：通过 SPM 分析发现，在野生型单体（MWT?）中，重要功能区域通过变构相互连接，而 V72I 突变后的单体（MV72I?）在关键位点的变构通讯受损，尤其是赤道结构域与单体其余部分之间。DF 分析进一步证实，突变导致蛋白大部分区域变构协调普遍丧失，但也有部分区域，如顶体结构域的α9?和α10?螺旋、赤道 β 链β1?、β2?和β18?，变构耦合增强，建立了更直接的变构通讯途径。
- 运动和构象变化：PCA 分析表明，MV72I?采样区域更受限，与实验预测的寡聚体稳定一致，其顶端结构域旋转和打开运动减少，更倾向于水解 ATP。从结构变量来看，MV72I?的动力学刚性增强，催化残基更易接近，可能有利于反应。
对七聚体单环复合物的影响
- 主成分分析和构象描述符：PCA 显示，与孤立单体相比，单环复合物（SWT?和SV72I?）中的单体构象自由度受限，顶端结构域倾向于关闭，催化天冬氨酸的排列无反应性。
- DF 分析：DF 分析显示，V72I 突变导致变构协调重新布线，中间结构域变构通讯中断，同时顶端结构域出现不对称的动态协调交替，这可能有利于部分单体向上运动与携带底物的伴侣蛋白接触。
对双环复合物的影响
- 主成分分析：PCA 分析表明，DWT?和DV72I?单体的整体基本空间与孤立单体相似，但DWT?和DV72I?倾向于采样更开放的构象。不过，在部分质子化状态下，DV72I?单体更倾向于保持开放的起始构象，而DWT?单体则更灵活，更易向顶端结构域关闭的构象移动。
- 构象描述符 γ：对构象描述符 γ 的分析发现，DWT?和DV72I?在顶端结构域开放角度上存在差异，DWT?有更多构象转变的可能性，这可能使其更能适应与伴侣蛋白 Hsp10 和底物蛋白的结合，有利于底物折叠。
- 构象描述符 δ 和反应性：研究发现，V72I 突变影响催化天冬氨酸的行为和反应性，不同质子化状态下，突变体与野生型在催化天冬氨酸距离分布上存在差异，突变体在某些情况下能使催化二聚体更接近，暗示其反应性增强。
- DF 分析：DF 分析表明，突变增加了某些顶端结构域的变构耦合，同时导致赤道和中间结构域的协调丧失，影响突变体与伴侣蛋白和激活底物的能力。
对足球形复合物的影响
- 主成分分析和构象描述符：由于 Hsp10 的存在，足球形复合物（FWT?和FV72I?）中的单体构象更刚性，顶端结构域更开放。FWT?的顶端结构域开放角度略超过 120°，而FV72I?更接近 120°，可能影响折叠腔容纳底物的能力。在催化天冬氨酸距离上，FV72I?与FWT?也存在差异，反映出突变对反应性的影响。
- DF 分析：DF 分析显示，突变对 Hsp10 单元的变构通讯影响因天冬氨酸质子化状态而异。在某些情况下，突变导致顶端结构域变构通讯增强，而在另一些情况下则导致与 Hsp10 单元的变构通讯受损。
研究结论表明，V72I 突变显著重塑了 Hsp60 单体和寡聚体的内部功能动力学，导致变构途径重新布线，增加了刚性并影响了反应性。这种影响从单体延伸到多蛋白组装体，改变了 Hsp60 与伴侣蛋白和底物的相互作用能力，进而影响蛋白质折叠效率，为理解 Hsp60 相关疾病的发病机制提供了原子水平的见解，也为开发针对这些疾病的治疗策略提供了理论基础。
研究的重要意义在于，它不仅揭示了 V72I 突变影响 Hsp60 功能的分子机制，还为进一步研究 Hsp60 的正常功能和其他相关突变的影响提供了重要参考。同时，有助于推动针对 Hsp60 相关疾病的药物研发，为改善患者的治疗效果带来新的希望。
在研究方法上，研究人员主要运用了原子分子动力学模拟技术，对多种 Hsp60 复合物进行模拟。通过对模拟轨迹进行 SPM、DF、PCA 等分析方法，从不同角度探究蛋白质的动态变化。此外，还结合了生化实验，对野生型和突变型 Hsp60 进行表达、纯化和生化表征，验证模拟结果。
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