谷氨酸棒杆菌代谢工程合成酪醇的两条途径：开启低成本生物制造新征程

　　为解决酪氨酸（l-tyrosine）提取效率低、化学合成成本高及大肠杆菌（E. coli ）生产含内毒素等问题，研究人员开展了利用谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）代谢工程合成酪醇（tyrosol）的研究。结果成功构建两条合成途径，且经酪氨酸途径产量更高。该研究为酪醇生产提供新方向。

为了促进科学的传播，生物通采集了这篇文章，如需英文原文，请点击！订阅BioHot索取原文

　　在当今生物制造领域，氧化损伤与多种疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、心血管疾病及癌症紧密相关。酪醇（2-[4 - 羟基苯基]- 乙醇）作为一种酚类化合物，对人体健康有着诸多益处，它不仅能保护组织和细胞免受氧化应激，还可作为关键药物前体，在制药行业用途广泛，比如用于合成治疗心血管疾病的 β₁- 受体阻滞剂和红景天苷 。

欢迎下载《杂交瘤技术制备单克隆抗体全流程》解决方案领 取

目前，酪醇的生产面临诸多挑战。化学合成法虽能制备酪醇，但存在前体昂贵、工艺条件苛刻等问题。从天然来源如橄榄油中提取酪醇，又因植物源中酪醇浓度低，提取成本高、效率低。微生物发酵生产酪醇成为备受关注的替代方法，然而常用的大肠杆菌生产过程中会产生脂多糖（又称内毒素），这种物质会引发人体发热甚至败血症休克等不良反应。

在此背景下，德国比勒费尔德大学（University of Bielefeld）的研究人员开展了深入研究，致力于探索利用谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）生产酪醇的新途径。该研究成果发表在《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》上，为酪醇的生产开辟了新方向。

研究人员采用了多种关键技术方法。在分子生物学方面，通过基因克隆和表达技术，对相关基因进行操作，构建表达载体并导入谷氨酸棒杆菌中；利用定点突变技术对基因进行修饰，改变蛋白质的氨基酸序列，以优化相关酶的功能；运用基因敲除技术，研究特定基因在酪醇合成途径中的作用。在分析检测方面，运用高效液相色谱（HPLC）和气相色谱 - 质谱联用（GC-MS）技术对发酵液中的酪醇、酪氨酸等物质进行定量和定性分析，准确测定其含量和纯度。

研究结果如下：

广告 聚焦食品安全和农残新国标！看赛默飞全套农残分析解决方案，赢取新年盲盒！

1. 谷氨酸棒杆菌对酪醇的生理反应：研究人员以已构建的 l - 酪氨酸高产菌株谷氨酸棒杆菌 AROM3 为基础，测试酪醇对其生长的影响。结果发现，随着酪醇浓度增加，菌株的比生长速率和生物量形成均下降，当酪醇浓度达到 65 mM 时，AROM3 无法生长，确定其抑制常数 Ki 为 22 mM。不过，AROM3 对酪醇的耐受性明显强于大肠杆菌，大肠杆菌在 25 mM 酪醇浓度下就会完全抑制生长。同时，培养 72 h 后，AROM3 并未降解酪醇，表明该菌株适合用于生产 g/L 规模浓度的酪醇。
2. 从 4-OH - 苯基丙酮酸生产酪醇：4-OH - 苯基丙酮酸是许多微生物 l - 酪氨酸合成的中间产物，但谷氨酸棒杆菌缺乏将预苯酸转化为 4-OH - 苯基丙酮酸的预苯酸脱氢酶（PDH）。研究人员尝试在 AROM3 中表达来自大肠杆菌的反馈抗性突变体双功能分支酸变位酶 / 预苯酸脱氢酶基因（tyrA_Ec^fbr），同时表达酿酒酵母的苯基丙酮酸脱羧酶基因（ARO10）。摇瓶培养实验显示，AROM3（tyrA_Ec^fbr）（ARO10_Sc）菌株在 168 h 内可产生 8.8±0.3 mM 酪醇（相当于 1.21±0.04 g/L）。进一步研究发现，敲除 dapC 基因虽降低了 l - 酪氨酸合成，但并未提高酪醇产量，反而使另一种代谢产物原儿茶酸（PCA）积累增加；敲除 qsuABD 基因虽减少了 PCA 积累，但酪醇积累仍未增加。
3. 4-OH - 苯基丙酮酸的天然合成：研究人员意外发现，仅表达 ARO10 基因就能使 AROM3 产生与同时表达 ARO10 和 tyrA_Ec^fbr基因时相同产量的酪醇，表明 tyrA_Ec^fbr并非酪醇生产所必需。后续实验表明，谷氨酸棒杆菌的天然转氨酶可依赖 2 - 氧戊二酸（2-oxoglutarate）（在较小程度上依赖丙酮酸）将 l - 酪氨酸转氨生成 4-OH - 苯基丙酮酸，进而转化为酪醇。同时，研究人员还确定了糠醛脱氢酶 FudC 是参与该途径的主要酶，敲除 fudC 基因可使酪醇合成减少 75%。
4. 通过酪胺生产酪醇：考虑到 4-OH - 苯基丙酮酸的不稳定性，研究人员探索了以酪胺为中间产物的合成途径。他们构建了表达短乳杆菌 l - 酪氨酸脱羧酶基因（tdc_Lb）和根瘤杆菌酪胺氧化酶基因（tyo_Kr）的菌株 AROM3（tdc_Lb）（tyo_Kr），该菌株可产生 13.5±1.1 mM 酪醇（相当于 1.87±0.15 g/L） 。通过共培养分别表达 tdc_Lb和 tyo_Kr的单质粒菌株，进一步提高了酪醇产量，达到 14.1±0.3 mM（1.95±0.04 g/L），同时减少了 l - 酪氨酸的残留。

研究结论和讨论部分指出，通过表达 ARO10 基因合成酪醇的途径中，4-OH - 苯基丙酮酸由 l - 酪氨酸经天然转氨酶合成，这一发现为 l - 酪氨酸的降解及相关产物的生产提供了新的理解。然而，由于转氨反应的平衡限制和 4-OH - 苯基丙酮酸的不稳定性，以酪胺为中间产物的途径更为优越。该途径不仅产量更高，生产速度更快，还减少了 l - 酪氨酸的残留，有利于下游加工。此外，谷氨酸棒杆菌独特的特性，如高 l - 谷氨酸水平和高 H₂O₂抗性，使其更适合采用 Tdc-Tyo 途径生产酪醇。

总的来说，该研究成功建立了两条从简单碳氮源合成酪醇的途径，为酪醇的生物制造提供了新的策略和理论依据，有望推动相关产业的发展，在生物燃料和生物产品领域具有重要的应用价值。

打赏

下载安捷伦电子书《通过细胞代谢揭示新的药物靶点》探索如何通过代谢分析促进您的药物发现研究

10x Genomics新品Visium HD 开启单细胞分辨率的全转录组空间分析！

欢迎下载Twist《不断变化的CRISPR筛选格局》电子书

单细胞测序入门大讲堂 - 深入了解从第一个单细胞实验设计到数据质控与可视化解析

下载《细胞内蛋白质互作分析方法电子书》