革兰氏阴性菌ABC型三组分外排泵MacAB-TolC的原位结构与动态组装机制解析

　　为解决革兰氏阴性菌多重耐药难题，中科院团队通过冷冻电子断层扫描技术(cryo-ET)首次揭示了MacAB-TolC外排泵的原位组装过程。研究发现抗生素存在时MacB会从MacA-TolC亚复合体解离，提出了"先形成MacA-TolC中间体"的组装模型，为设计靶向外排泵抑制剂提供了新思路。该成果发表于《Communications Biology》。

　　

在抗生素滥用日益严重的今天，革兰氏阴性菌的多重耐药性(MDR)已成为全球公共卫生的重大威胁。这些细菌通过跨膜外排泵将抗生素主动排出胞外，其中MacAB-TolC作为ATP结合盒(ABC)型三组分外排泵的典型代表，能特异性转运大环内酯类抗生素和毒力因子。尽管其晶体结构已被解析，但天然状态下泵体的组装机制仍存在两大谜团：一是完整复合体难以纯化，暗示组分间结合力较弱；二是组装路径存在争议——究竟是MacA-MacB先结合再招募TolC，还是MacA-TolC先形成中间体？

来自中国的研究团队通过冷冻电子断层扫描(cryo-ET)和亚断层图像平均技术，首次在近天然状态下解析了大肠杆菌中MacAB-TolC泵的原位结构。研究采用BL21(DE3)菌株过表达系统，通过比较未处理组和红霉素处理组的差异，结合体内光交联实验，揭示了这一关键耐药元件的动态组装过程。主要技术包括：冷冻电子断层扫描成像、亚断层图像平均、最小抑菌浓度(MIC)测定、基于对苯甲酰苯丙氨酸(Bpa)的位点特异性光交联等。

研究结果部分：

1. 可视化E. coli细胞包膜中的MacAB-TolC泵
   在未处理细胞中观察到完整的三组分泵结构，其跨膜通道连接内外膜并贯穿整个包膜。通过5183个颗粒的亚断层平均获得14?分辨率结构，证实MacB的PLD(周质环域)与MacA存在相互作用。

2. 红霉素促进MacB从MacAB-TolC解离
   红霉素处理后发现MacB区域密度显著减弱，通过聚焦分类获得缺失MacB的MacA-TolC亚复合体结构(12?)。免疫印迹证实红霉素不影响MacB表达量(p=0.8543)，但特异性降低MacA-MacB相互作用。

3. 体内光交联验证MacB动态结合
   选择MacB^L495Bpa和MacA^V269Bpa等关键位点进行光交联，发现红霉素处理使MacA-MacB复合物形成显著减少(分别p=0.0045和p=0.0093)，支持结构观察结果。

讨论与结论：
该研究首次证实MacAB-TolC在生理环境下存在"MacA-TolC先行组装"的路径，这与RND家族的AcrAB-TolC泵的组装机制形成鲜明对比。当存在红霉素等底物时，MacB通过ATP水解提供能量完成药物外排后，会从复合体解离形成MacA-TolC中间态。这一发现为理解ABC型外排泵的动态调控提供了结构基础，特别是指出MacA-TolC亚复合体可作为新型抑制剂的理想靶点。研究还提出ATP结合可能稳定MacB与MacA-TolC的结合，而ADP结合则促进解离，这解释了为何体外难以纯化完整复合体。

论文的创新性在于：首次在近生理条件下捕捉到外排泵的组装中间态；揭示了抗生素压力下泵体的动态重构；为针对不同家族外排泵的差异化抑制策略提供了理论依据。该成果于2025年发表在《Communications Biology》，为破解革兰氏阴性菌耐药难题开辟了新的结构生物学研究范式。