牛津纳米孔测序技术在FFPE组织和液基细胞学样本中HPV分型验证及其临床应用价值

　　本研究针对HPV（人乳头瘤病毒）基因分型在头颈部FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）组织和肛管/妇科ThinPrep液基细胞学样本中的应用瓶颈，开发了基于牛津纳米孔技术（ONT）的快速检测方案。研究人员通过181例样本验证显示：该方法对HPV16/18的检测限达1 copies/μL，分型准确率超95%，且能检出Sanger测序遗漏的亚型。该成果为头颈癌等HPV相关肿瘤的病理诊断提供了新型分子工具，相关论文发表于《The Journal of Molecular Diagnostics》。

　　

人乳头瘤病毒（HPV）与多种癌症的关联早已明确，但传统检测方法正面临双重挑战：一方面，商业试剂盒多局限于妇科样本的高危型检测；另一方面，随着HPV相关头颈癌发病率激增，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织这类疑难样本的精准分型需求日益迫切。更棘手的是，现有金标准Sanger测序存在通量低、耗时长等缺陷，而二代测序又面临成本过高的问题。这一背景下，牛津纳米孔技术（ONT）因其长读长、实时分析的特性，为HPV分子诊断带来了新的可能性。

来自某研究机构的研究团队首次系统评估了ONT在头颈部FFPE样本中的HPV分型效能。研究纳入181例样本，包括头颈部FFPE组织、肛管及妇科ThinPrep液基细胞学样本，通过GP5+/GP6+引物扩增HPV L1基因区域，结合ONT测序与Sanger测序对照分析。关键技术涉及：1）建立基于L1基因的PCR扩增体系；2）优化ONT文库构建流程；3）采用生物信息学流程进行基因分型；4）通过系列稀释实验确定检测限（LOD）。

【Analytical Performance】
• 检测灵敏度：对HPV16/18的LOD达到1 copies/μL，较传统方法提升10倍
• 分型一致性：与Sanger测序比较显示kappa系数=1.0，且在5例样本中检出Sanger遗漏的混合感染
• 重复性验证：批内/批间变异系数<5%，150bp靶序列覆盖度达100%

【DISCUSSION】
该研究突破性地证实ONT可精准识别FFPE样本中的HPV亚型，尤其解决了头颈癌组织因核酸降解导致的检测难题。方法学优势体现在：1）单次运行可同时分析48个样本，成本降低60%；2）平均测序时长4小时，较二代测序提速8倍；3）成功检出HPV52/58等中国常见高危型。这些发现为HPV相关肿瘤的分子流行病学研究提供了标准化工具，特别适用于资源有限地区的癌症筛查。

值得注意的是，研究也揭示了ONT在低频突变检测方面的局限——当病毒载量<10^-2
copies/μL时可能出现假阴性。未来可通过引入CRISPR富集技术进一步优化灵敏度。该成果的临床转化将显著提升头颈癌等非妇科HPV相关肿瘤的诊疗水平，为个体化疫苗策略提供分子依据。