血浆cfDNA微生物组分析在肺癌诊断中的挑战与机遇：基于靶向测序与全外显子测序的比较研究

　　本研究针对血浆微生物DNA检测中因宿主DNA干扰导致的假阳性问题，通过对比Kraken 2与IPD2两种生物信息学工具在261例肺腺癌患者血浆样本（靶向测序10,000×深度、全外显子测序340×深度）中的表现，发现Kraken 2的微生物负荷估算值可达IPD2的416倍（如Bacillus属），证实严格生物信息学流程对cfDNA微生物组分析的重要性，为癌症未知原发灶诊断提供新思路。

　　

微生物感染与约20%的恶性肿瘤发生相关，从幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）到人乳头瘤病毒（HPV），病原体与特定癌症的关联已被广泛证实。然而，在血浆游离DNA（cfDNA）中检测微生物信号却面临巨大挑战——宿主DNA占比高达99%，微生物DNA如同"大海捞针"。更棘手的是，常用的生物信息学工具可能将人类序列误判为微生物序列，导致假阳性结果。这一问题在肺癌等缺乏明确微生物标志物的癌症中尤为突出，严重阻碍了基于cfDNA的癌症早诊和溯源研究。

为解决这一难题，来自塔塔纪念医院和合作机构的研究团队在《npj Systems Biology and Applications》发表了一项开创性研究。该团队对50例肺腺癌患者的261份血浆样本进行多维度分析：采用OncoIndx面板进行深度10,000×的靶向测序，同时对18例基线样本进行340×深度的全外显子测序（WES）。通过对比Kraken 2（基于k-mer算法）与IPD2（整合宿主序列去除技术）两种微生物检测工具的性能，揭示了当前cfDNA微生物组分析的关键瓶颈与技术优化方向。

研究主要采用三种关键技术：1）高深度靶向测序（OncoIndx面板）与中深度全外显子测序（Agilent SureSelect V8）；2）双路径生物信息学分析（Kraken 2标准数据库 vs IPD2病原体专用数据库）；3）多癌种验证（51例肺癌、27例胆囊癌、46例头颈癌组织WES数据重分析）。所有样本均来自塔塔纪念医院经病理确诊的肺腺癌患者队列，并设置严格防污染措施（HEPA洁净室、DNA-free耗材）。

微生物分析方法的比较
通过对比243份靶向测序样本中20个常见菌属的检测结果，发现Kraken 2的读数普遍高于IPD2：Pseudomonas属平均读数1.042 vs 0.025（41.7倍差异），Staphylococcus属差异更达151倍。这种差异在WES数据中同样显著，如Cupriavidus属的Kraken 2读数（20.97 FPM）是IPD2（0.272 FPM）的77倍。

血浆与组织微生物特征关联
对18例血浆WES样本的分析发现，Pasteurella、Toxoplasma和Pseudomonas是主要菌属。主成分分析显示，血浆WES的微生物特征与肺癌组织WES高度相似（图1b），提示血浆微生物组可能反映肿瘤微环境特征。

跨癌种微生物特征差异
通过分析124例不同癌症组织样本，发现肺癌特异性富集Pseudomonas（与Greathouse等报道一致），而胆囊癌和头颈癌分别呈现Salmonella、Fusobacterium特征。这种差异为癌症溯源提供了潜在生物标志物。

该研究首次系统评估了cfDNA微生物组分析在肺癌诊断中的可行性，揭示三个关键结论：1）生物信息学工具选择显著影响结果，Kraken 2可能高估微生物负荷416倍（如Bacillus属）；2）血浆WES能捕获与肿瘤组织相似的微生物特征；3）不同癌症具有独特微生物"指纹"。这些发现为优化液体活检技术提供了重要依据——特别是在癌症未知原发灶（占全球癌症2-5%）的诊断中，血浆微生物组或可成为新型分子指南。

研究同时指出当前技术的局限性：缺乏阴性对照、样本量较小（n=50），且WES并非微生物检测最优平台。作者强调未来需开发特异性捕获探针并建立标准化分析流程。正如团队在讨论中指出："当使用宿主DNA捕获技术研究微生物组时，必须实施像IPD2这样的双阶过滤系统，以区分真实信号与数据库污染"。这一警示对正在兴起的癌症微生物组研究具有普适性指导价值。