酶法合成位点特异性S/O-连接N-糖肽：揭示糖苷键模式对生物活性的影响及其在糖基化工程中的应用

　　本研究针对肽类/蛋白药物糖基化工程中缺乏高效、可扩展的β-N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)定点修饰策略的难题，开发了基于SvGT和EndoCCN180H 的双酶法体系，成功构建了具有天然β-S/O-糖苷键的N-糖肽。通过比较GLP-1类似物的受体激活能力与降血糖活性，首次证实S-糖基化与天然N-糖基化具有相当的生物活性，为简化糖蛋白药物开发提供了新思路。

　　

在生物制药领域，糖基化修饰犹如给蛋白质"穿上糖衣"，能显著改善药物的溶解性、稳定性和疗效。然而，天然糖蛋白的异质性就像"糖衣款式不统一"，导致治疗效果参差不齐。更棘手的是，传统化学合成法如同"手工缝制糖衣"，步骤繁琐且成本高昂。尤其对于糖尿病明星药物胰高血糖素样肽-1(GLP-1)而言，其2分钟的短暂半衰期更让研究者们对糖基化修饰技术求贤若渴。

河北省某研究团队在《Carbohydrate Polymers》发表的研究中，创新性地将链霉菌来源的S/O-己糖胺转移酶(SvGT)与内切糖苷酶突变体(EndoCC^N180H
)组成"酶法流水线"，实现了GLP-1类似物的精准糖基化改造。关键技术包括：1）利用SvGT在特定五肽序列(YX¹
XX²
G)上安装GlcNAc"挂钩"；2）通过EndoCC^N180H
将完整N-糖链转移到"挂钩"上；3）采用db/db糖尿病模型小鼠评估降糖活性。

【材料与方法】
研究选用含A8G突变的GLP-1(7-37)为模板，在34位点引入S/O/N-糖基化位点。通过质谱和HPLC监控反应进程，确保获得均一糖基化产物。

【结果与讨论】

1. 糖基化模式影响：S-糖基化产物展现出与天然N-糖基化相当的受体激活能力(EC₅₀
   值相近)，而O-糖基化活性降低约30%，揭示β-糖苷键的立体构型对维持生物活性至关重要。
2. 降糖效果：在糖尿病模型中，S-糖基化GLP-1的血糖控制能力与N-糖基化版本无统计学差异，且显著优于未糖基化对照组。
3. 机制解析：保持天然β-糖苷键构型(无论是S-或N-连接)可维持GLP-1与受体的正确相互作用，而糖链体积对活性的影响小于预期。

该研究不仅建立了首个全酶法S-糖基化平台，更颠覆了"必须严格模仿天然N-糖基化"的传统认知。其重要意义在于：1）SvGT的最小识别基序(YX¹
XX²
G)可突破天然糖基化位点限制；2）为开发长效GLP-1类药物提供了更经济的生产路径；3）证实糖基化工程可"求同存异"—只要保留关键β-糖苷键，连接氨基酸的替换(S→N)不影响核心功能。这种"形异神同"的发现，为简化糖蛋白药物设计提供了理论依据。