SARS-CoV-2长期连续传代揭示趋同进化特征：病毒适应性突变与公共卫生意义

　　这篇研究通过长期连续传代（serial passaging）实验，系统分析了SARS-CoV-2在Vero E6细胞中的进化动态，揭示了病毒在无宿主免疫压力下仍能通过趋同进化（convergent evolution）获得与临床流行株相似的关键突变（如S:H655Y、S:R682W）。研究覆盖9个病毒谱系（含4个关切变异株VOC），最长传代达100次，证实突变积累速率（1×10–6 –2×10–6 /位点/复制周期）与刺突蛋白（spike）以外的基因组区域（如nsp14）同样重要。发现为理解病毒跨宿主适应机制、预测进化轨迹及疫苗设计提供了关键数据。

　　

引言

COVID-19大流行期间，全球基因组测序（WGS）揭示了SARS-CoV-2的快速进化。尽管临床数据丰富，但受限于宿主免疫、治疗压力等混杂因素，难以明确突变的选择机制。本研究通过体外连续传代实验，在Vero E6细胞（缺乏TMPRSS2表达）中模拟病毒长期进化，填补了临床观察与实验室研究的空白。

材料与方法

实验设计：选取9个谱系（含Alpha、Beta等VOC），传代33–100次，每3代进行全基因组测序。使用Midnight扩增方案和Illumina MiSeq平台，通过定制生物信息学流程（COVID-Illumina-Snakemake）分析突变动态。
关键参数：设定变异等位基因频率（VAF）阈值0.1（SNP）和0.25（indel），追踪突变丢失（original_lost）、保留（original_retained）、新增暂现（new_transient）及持续（new_persistent）四类变异。

结果与讨论

突变积累模式：

• 无进化平台期：B.1.319谱系（POW005）在100代传代中持续积累131个新突变，包括58个错义突变和2个框内缺失，未出现复制适应性下降。
• 热点区域：刺突蛋白（spike）突变频率与基因组其他区域相当，但结构蛋白（如M、ORF7a/b）突变率更高。
• 趋同进化：12个突变在多个谱系中独立出现，如S:H655Y（6/9谱系）和S:R682W（4/9谱系），后者与furin切割位点（PRRAR）邻近，可能增强内体途径感染。

功能关联突变：

• 复制相关：nsp14:P203L（与复制保真度下降相关）在POW007中低频出现；nsp5:T21I（卡帕谱系）与抗病毒药物耐药性相关。
• 免疫逃逸：S:A67V、S:S373P等临床关联突变在无免疫压力下仍频繁出现，提示其可能通过非免疫机制（如细胞嗜性改变）获得选择优势。

瓶颈效应：

• POW003（A.2.2）在24–27代间出现单倍型替换，多个突变突然固定，反映传代过程中的遗传漂变。类似现象在ORF8区域高频突变中亦被观察到，可能与纯化选择放松有关。

意义与展望

本研究首次在长周期传代中证实：

1. SARS-CoV-2通过趋同进化重复获得临床相关突变（如S:H655Y），提示这些位点可能具有普适性适应优势；
2. Vero E6细胞培养会特异性选择内体途径感染相关突变，为疫苗株优化提供警示；
3. 非刺突蛋白区域（如nsp14）的进化动态被低估，需纳入未来监测体系。

数据可作为突变功能预测的“预演库”，尤其关注尚未在临床中广泛出现但体外频繁固定的突变（如S:YQTQTN674Y缺失）。研究强调结合体外模型与流行病学数据，才能全面解析病毒进化驱动力。