苹果MdNAC25启动子自然变异通过双向增强子调控果实成熟期的分子机制

　　【编辑推荐】苹果果实成熟期调控机制不明制约品质育种。中国研究人员通过多组学分析发现MdNAC25启动子4-bp缺失变异（ACS2-TAAAATAT）驱动等位基因特异性表达（ASE），其作为双向增强子同时激活上游lncRNA-nac25表达，二者协同促进早熟表型。该研究首次揭示lncRNA-NAC转录因子调控模块在蔷薇科果树中的保守性，为分子设计育种提供新靶点。

　　

苹果作为全球最重要的温带水果，其采收期的精准调控直接关系到果实品质和市场供应。然而，果实成熟是一个复杂的数量性状，受多基因网络和环境因素共同影响。尽管已知NAC转录因子家族在番茄（NOR基因）和苹果（MdNAC18.1）中调控成熟过程，但不同苹果品种间成熟期差异的遗传基础仍不清楚。更关键的是，启动子区顺式调控元件的自然变异如何通过等位基因特异性表达（ASE）影响成熟表型，仍是未解之谜。

为解决这一科学问题，中国农业科学院郑州果树研究所的研究团队联合多家单位，通过对154个苹果种质的全基因组关联分析，锁定染色体10上的MdNAC25（MD10G1299900）为关键候选基因。研究发现，其启动子区4-bp缺失（TAAA）产生的ACS2-TAAAATAT顺式元件，不仅能增强自身表达，还双向激活上游反向转录的lncRNA-nac25，形成独特的"lncRNA-NAC"调控模块。这一发现不仅解释了栽培苹果早熟性状的驯化选择机制，还为跨物种果实成熟调控提供了新见解，相关成果发表于《Horticultural Plant Journal》。

关键技术方法
研究采用多组学整合策略：1）基于苹果'Royal Gala'基因组和转录组数据鉴定ASE基因；2）通过启动子-LUC报告系统验证4-bp缺失的调控功能；3）利用病毒诱导基因沉默（VIGS）和农杆菌瞬时转化分析lncRNA-nac25功能；4）在番茄nor突变体中异源表达MdNAC25进行功能互补；5）对蔷薇科5个物种的NAC25同源基因进行系统进化和表达模式分析。

主要研究结果

3.1 MdNAC25等位基因特异性表达
通过比对'Royal Gala'（RG）与参考基因组GDDH13.1，发现MdNAC25编码区存在5个SNP和6-bp indel变异。RNA-seq显示RG等位基因表达占比达80%，显著偏离1:1比例。在9个栽培品种中均检测到类似ASE现象，暗示其受保守调控机制支配。

3.2 4-bp缺失驱动ASE
启动子区比较发现，含4-bp缺失（形成ACS2-TAAAATAT元件）的等位基因在烟草中LUC活性提高2.3倍。值得注意的是，该元件与番茄LeACS2启动子中已知的成熟调控元件完全一致，揭示了跨物种保守性。

3.3 lncRNA-nac25的双向调控
在MdNAC25上游2.8 kb处新鉴定到401 bp的lncRNA-nac25，其表达与MdNAC25呈显著正相关（r=0.89）。通过VIGS沉默实验证明，lncRNA-nac25可上调MdNAC25表达，且二者共享ACS2-TAAAATAT双向增强子。

3.4 早熟表型关联分析
群体遗传学显示，携带4-bp缺失的MdNAC25^+/-
品种（占栽培种33%）较野生种（11%）更普遍，且平均早熟11天。转录组重分析证实，杂合型品种中MdNAC25表达量是纯合型的1.8倍。

3.5 番茄功能验证
在番茄nor突变体中过表达MdNAC25可恢复PG2、ACS2等成熟相关基因表达，使类胡萝卜素含量提升3倍。在Micro-Tom中过表达则使转色期提前7-16天，证实其功能保守性。

3.6 蔷薇科保守性分析
系统进化显示，桃PpNAP6、梨PpNAC25等同源基因均含TAAAATAT元件，且在果实成熟期高表达。特别在桃中，PpNAP6已被证实调控乙烯合成通路。

结论与意义
该研究首次阐明苹果果实成熟期的表观遗传调控新机制：启动子自然变异（4-bp缺失）通过创建双向增强子ACS2-TAAAATAT，协同激活lncRNA-nac25和MdNAC25表达，形成正向反馈环路加速成熟。这一发现具有三重意义：1）为苹果早熟育种提供分子标记；2）揭示lncRNA-NAC模块在蔷薇科的保守调控网络；3）提出"顺式元件-非编码RNA-转录因子"的三级调控模型，为其他作物品质改良提供范式。

值得注意的是，研究还发现栽培种中4-bp缺失等位基因的高频出现（33% vs 野生种11%），反映了人类在驯化过程中对早熟性状的无意识选择。未来研究可进一步解析ACS2-TAAAATAT元件的结合蛋白，以及lncRNA-nac25调控MdNAC25的具体分子机制。