减毒禽副鸡杆菌2019/HB64-40株的构建及其作为鸡传染性鼻炎活疫苗候选株的潜力评估

　　本研究针对禽副鸡杆菌(Av. paragallinarum)引起的鸡传染性鼻炎(IC)现有灭活疫苗存在交叉保护不足等问题，通过Tn5-Kan转座子构建突变库，筛选出ksgA基因缺陷的减毒株2019/HB64-40。该株生物膜形成能力下降（OD<4×ODc）、血凝效价降低至21 ，动物实验显示免疫组临床评分仅0.1（对照组2.1），提供90%同源保护率，为开发新型活疫苗奠定基础。

　　

鸡传染性鼻炎（Infectious Coryza, IC）是困扰全球家禽业的顽疾，由禽副鸡杆菌（Avibacterium paragallinarum）引发，典型症状包括面部肿胀、鼻腔分泌物增多，导致蛋鸡产蛋下降和肉鸡生长迟缓。当前防控主要依赖灭活疫苗，但存在两大痛点：一是血清型间交叉保护有限（如A1-A4型间保护率低），二是疫苗失效事件频发（中国部分地区免疫后仍暴发疫情）。更棘手的是，灭活疫苗含细菌脂多糖等成分，易引发接种不良反应。这些困境催生了研究者对新型疫苗的探索——减毒活疫苗因其模拟自然感染途径、能诱导全面免疫应答的优势，成为破局希望。

扬州大学的研究团队独辟蹊径，选择从细菌的"生存技能"入手。生物膜（biofilm）作为细菌的"防护盾"，与毒力、耐药性密切相关。研究者利用Tn5-Kan转座子对野生株2019/HB64进行随机突变，通过结晶紫染色法（OD₆₀₀
检测）筛选到生物膜形成能力骤减的突变株2019/HB64-40。染色体步移技术锁定其突变基因为ksgA——该基因编码的16S rRNA腺苷二甲基转移酶是核糖体30S亚基组装的关键"质检员"。这把"基因剪刀"不仅剪断了生物膜形成链（OD值从野生株>4×ODc降至≤2×ODc），还意外削弱了细菌的"黏附能力"：血凝效价从2⁸
暴跌至2¹
，但DF-1细胞黏附实验显示其黏附率未显著改变。

研究团队通过SPF鸡模型展开攻毒试验，设计了三重防线验证减毒效果：临床评分、病理观察和排菌检测。未免疫组在攻毒后2天全部出现严重症状（面部肿胀评分3分），而突变株免疫组仅1/10出现轻微症状（评分0.1）。解剖可见典型差异：野生株攻毒组眶下窦充满黄色干酪样渗出物，气管黏膜出血；免疫组则仅见轻微充血。更关键的是，qPCR检测显示免疫组排菌量断崖式下降——攻毒5天后排菌量（9.50×10²
copies）较对照组（5.91×10⁴
copies）降低98%。组织病理学进一步证实，免疫组仅见气管纤毛局部黏附，而对照组出现黏膜下层水肿伴巨噬细胞浸润。

这项发表于《Veterinary Research》的研究首次将ksgA基因与禽副鸡杆菌毒力关联，揭示核糖体甲基化修饰影响病原体定植的新机制。研究构建的2019/HB64-40株展现三大应用优势：安全性（连续传代20代性状稳定）、有效性（同源保护率达90%）和便捷性（单次免疫即可）。虽然尚未验证跨血清型保护，但其在中国主要流行血清型A中的优异表现，为替代现行多价灭活疫苗提供可能。未来研究需关注该候选株与野毒株的竞争性定植关系，以及免疫持续期等产业化关键参数。

关键技术方法

1. 转座子突变库构建：采用Tn5-Kan转座子对野生株2019/HB64进行随机插入突变
2. 表型筛选：结晶紫染色法量化生物膜（OD₆₀₀
   ），血凝试验检测HA效价
3. 基因定位：染色体步移技术结合特异性引物（SPF1-3）鉴定插入位点
4. 动物实验：28日龄SPF白来航鸡（购自勃林格殷格翰）分三组（免疫组/攻毒组/对照组）
5. 效果评估：qPCR定量排菌量（引物APG-F/R），H&E染色观察病理变化

研究结果
Characterization of the Av. paragallinarum mutant strain 2019/HB64-40
突变株生物膜形成能力显著减弱（p<0.05），血凝效价降低4个滴度，生长曲线显示其对数期延后且平台期OD₆₀₀
值降低20%。

Pathogenicity of the Av. paragallinarum mutant in chickens
攻毒3天后野生株组发病率100%，突变株组仅26.7%（4/15）；7天后突变株组排菌量（2.17×10⁴
copies）较野生株组（5.45×10⁴
copies）降低60%。

Protective efficacy of the attenuated live vaccine candidate strain 2019/HB64-40
免疫组体重增长与对照组无差异（p>0.05），攻毒后临床评分降低96%（0.1 vs 2.5），眶下窦病变发生率下降70%。

讨论与意义
该研究突破现有灭活疫苗的技术天花板，首次将核糖体装配调控基因ksgA作为减毒靶点。突变株通过削弱生物膜形成——这种"去装甲"策略既降低细菌环境抗性，又保留免疫原性关键表位。值得注意的是，虽然血凝素（HA）效价降低可能影响部分血清型识别，但在同源血清型中仍能激发有效保护，提示除HA外可能存在其他保护性抗原。研究为禽副鸡杆菌疫苗开发提供新范式：通过精准扰动细菌基础代谢通路（如rRNA甲基化）而非传统毒力因子，实现安全性与免疫原性的平衡。未来可探索该策略在其他禽病原体（如鸡毒支原体）中的应用，或结合CRISPR技术构建多基因减毒株以增强交叉保护。