杨树胞嘧啶碱基编辑系统的协同优化：提升精准度与效率的突破性研究

　　本研究针对杨树中胞嘧啶碱基编辑器(CBE)效率低、副产物多的问题，通过整合MS2-UGl系统、融合Rad51 DNA结合域和优化核定位信号，开发了hyPopCBE-V4系统。该系统将纯净C→T编辑比例从20.93%提升至40.48%，纯合编辑效率从4.65%增至21.43%，并成功创制抗除草剂杨树种质。该研究为木本植物精准基因编辑提供了新工具，对林业育种具有重要应用价值。

　　

在植物基因编辑领域，CRISPR/Cas9技术革命性地改变了遗传修饰的方式，其中胞嘧啶碱基编辑器(CBE)因其无需引入DNA双链断裂(DSBs)和供体模板的特性备受关注。然而在木本植物尤其是杨树中，现有CBE系统面临三大瓶颈：编辑效率低下、副产物(C→G/C→A/indel)频发、编辑窗口过宽。这些问题严重制约了该技术在林业育种中的应用，而传统除草剂对幼苗的毒害作用更是林业生产中的长期痛点。

北京林业大学的研究团队在《Communications Biology》发表的研究中，以杨树杂交种84K为材料，通过多组分协同优化策略开发了hyPopCBE系统。研究人员首先基于A3A/Y130F-BE3构建基础编辑器hyPopCBE-V1，随后分三步整合三大创新元件：MS2-UGI系统通过增加尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)拷贝数提高编辑纯度；Rad51 DNA结合域(DBD)增强单链DNA结合能力；牛痘病毒衍生核定位信号(bpNLS)替代传统SV40NLS。最终获得的hyPopCBE-V4展现出协同效应，在PagALS基因Pro197位点实现精准编辑。

关键技术包括：农杆菌介导的杨树稳定转化、Hi-TOM 2.0深度测序分析编辑模式、实时定量PCR验证基因表达、双除草剂（嘧磺隆和烟嘧磺隆）抗性表型评估。研究选用四倍体杨树的四个PagALS同源基因作为靶标，通过设计通用sgRNA实现多位点同步编辑。

研究结果

Selection of sgRNA targeting PagALS homologs and construction of CBE base editing vectors
通过基因组比对鉴定出PagALS四个同源基因（A01/G01/A02/G02），表达分析显示A01/A02为主导基因。设计的sgRNA可同时靶向四个基因的保守区域，为后续多重编辑奠定基础。

Comprehensive analysis of cytosine modification patterns and efficiency across hyPopCBE vector variants in poplar
对148株转基因杨树的分析显示，hyPopCBE-V4将纯净C→T编辑比例提升至40.48%（V1仅20.93%），编辑窗口从C₄
-C₁₃
缩窄至C₇
-C₈
。值得注意的是，C₈
位点编辑效率达42.99%，而副产物中C→Del占比最高。

Optimization enhances allelic and homozygous editing efficiency in poplar base editing
hyPopCBE-V4使有效双等位基因编辑效率达45.24%（V1为27.91%），纯合四基因编辑效率提升至21.43%（V1仅4.65%）。CRISPR-GE预测的潜在脱靶位点均未检测到突变，证实系统安全性。

Mutation of the PagALS gene to create herbicide-resistant poplar
在21株无副产物的编辑株系中，5株实现四基因纯合P197L突变。喷洒3000 mg/L嘧磺隆（推荐剂量150倍）30天后，突变体生长正常而野生型死亡；0.5 mg/L烟嘧磺隆培养基中，突变体茎段再生能力显著优于对照。

讨论与意义
该研究通过"元件协同"而非"简单叠加"的策略，首次在木本植物中实现MS2-UGI与Rad51 DBD的协同增效。hyPopCBE-V4的独特优势体现在三方面：编辑效率提升（C₇
/C₈
位点效率增加15.73%/9.76%）、副产物减少（平均从13.87%降至6.33%）、编辑窗口精准化。研究同时发现同源基因编辑效率差异（A01/G01＞A02/G02）可能与染色质状态相关，这为后续研究提供了新方向。

在应用层面，研究创制的抗除草剂杨树新品系可直接解决林业苗圃杂草治理难题。理论上，四基因纯合突变体对ALS抑制剂类除草剂的抗性应呈现累加效应，这与油菜等作物中的研究结论一致。技术层面，该研究建立的优化策略可推广至其他木本植物，为森林树木复杂性状研究提供新范式。未来研究可进一步探索染色质开放剂对编辑效率的影响，以及不同P197突变类型（如P197F/P197S）的抗性谱差异。

这项由Han Liu、Mengyu Zhang等完成的研究，不仅开发了杨树精准编辑新工具hyPopCBE-V4，更通过PagALS基因编辑实证了其在抗逆育种中的价值，为林业可持续发展提供了创新性解决方案。