海参新型WAP结构域蛋白AjSWD的抗菌免疫机制解析及其在刺参先天免疫中的重要作用

　　本研究针对水产养殖中刺参(Apostichopus japonicus)易受 Vibrio splendidus 感染导致重大经济损失的问题，克隆鉴定了新型单WAP结构域蛋白AjSWD。研究发现重组AjSWD及其WAP结构域(rAjSWD-WAP)通过破坏细菌细胞膜实现广谱抗菌，显著提高感染后幼参存活率，其中rAjSWD-WAP展现出更优抗菌效能，为海洋无脊椎动物先天免疫机制研究提供了新视角。

　　

水产养殖业中，刺参(Apostichopus japonicus)作为高经济价值物种，长期受到病原菌Vibrio splendidus的威胁，由其引发的皮肤溃疡综合征每年造成超300亿元经济损失。海洋无脊椎动物缺乏适应性免疫系统，完全依赖先天免疫防御机制，其中富含WAP(Whey Acidic Protein)结构域的蛋白(WD proteins)是关键效应分子。然而，关于棘皮动物WD蛋白的免疫功能和机制研究仍存在巨大空白。

宁波大学研究团队从刺参基因组库中克隆鉴定出新型单WAP结构域蛋白AjSWD，其cDNA全长1112 bp，编码含WAP结构域(10-55 aa)和KAZAL结构域(99-147 aa)的215个氨基酸蛋白。通过qPCR检测组织分布，发现AjSWD在体壁中表达最高；经V. splendidus刺激后，体壁和体腔细胞中mRNA及蛋白表达显著上调。研究采用原核表达获得重组蛋白rAjSWD及其WAP结构域片段rAjSWD-WAP，通过细菌凝集实验、病原相关分子模式(PAMPs)结合实验和最小抑菌浓度(MIC)测定评估抗菌功能，并结合扫描电镜观察细菌形态变化。动物保护实验则监测了重组蛋白处理后的幼参存活率。

Characterization of AjSWD sequence
生物信息学分析揭示AjSWD的WAP结构域具有典型8个保守半胱氨酸残基(C1-C8)，形成四二硫键核心(4DSC)结构，其分子量为23.7 kDa，等电点(pI)为8.34。

Multiple sequence alignments and phylogenetic analysis
系统进化分析显示AjSWD与节肢动物Crustin家族聚为一支，但具有独特的KAZAL结构域组合模式。

Antibacterial function and mechanism
功能实验证实rAjSWD和rAjSWD-WAP对革兰氏阴性菌V. splendidus均表现出剂量依赖性抗菌活性，其中rAjSWD-WAP的MIC更低(6.25 μg/mL vs 12.5 μg/mL)。电镜观察显示处理后的细菌出现细胞膜破裂和内容物泄漏，证实其通过膜破坏机制杀菌。

Protective effect in vivo
攻毒实验显示，rAjSWD和rAjSWD-WAP处理组幼参72小时存活率分别提高40%和55%，显著高于对照组(P<0.01)。

该研究首次阐明刺参AjSWD通过WAP结构域介导膜破坏机制发挥抗菌功能，其KAZAL结构域可能参与免疫调控协同作用。相较于全长蛋白，单独WAP结构域展现更强抗菌效能，为设计新型抗菌肽提供了理论依据。研究成果不仅丰富了海洋无脊椎动物先天免疫理论，更为刺参细菌性疾病的防控策略开发奠定了分子基础。论文发表于《Aquaculture》，对推动水产养殖业可持续发展具有重要实践价值。